C, atau G, B nukleotida C, G, atau T, dan M nukleotida A atau C.

V. OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI

Abstrak Protein homeodomain leucin zipper HD-Zip merupakan suatu famili faktor transkripsi yang hanya ditemukan pada tanaman. OsHox6 adalah anggota dari HD-Zip sub-famili I pada tanaman padi. Ekspresi OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Untuk mengetahui fungsi gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi sawah Ciherang dan IR64 transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Empat galur I.19, I.23, I.33, dan I.40 tanaman padi transgenik IR64 yang mengandung satu salinan transgen berdasarkan Southern blot lebih toleran pada kondisi kekeringan, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya. Konfirmasi ekspresi gen akan dilakukan. Penampilan morfologi tanaman transgenik berdasarkan pengamatan tinggi tanaman tidak berbeda dengan kontrolnya. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui cara kerja OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan. Kata Kunci : Gen OsHox6, promoter OsLEA3, padi transgenik, tingkat kelangsungan hidup, toleran kekeringan Abstract Homeodomain leucine zipper HD-Zip proteins constitute a family of transcription factors unique to plants. OsHox6 is a member of rice HD-Zip sub- family I. It is regulated at the transcriptional level by water availability. In order to establish if this gene plays a functional role in drought responses, transgenic rice plants Ciherang and IR64 containing OsHox6 gene driven by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic lines of IR64 I.19, I.23, I.33, and I.40 containing single copy of transgene were more tolerant to water stress conditions, showed by higher survival rates than wild-type plants. The expression level of OsHox6 gene in these transgenic plants will be confirmed. The morphological performance of transgenic plants having an extra copy of transgene were similar to that of wild type plants. Further investigations are required to evaluate the modulation of drought tolerance by OsHox6. Key words: OsHox6 gene, OsLEA3 promoter, transgenic rice, survival rate, drought tolerance Pendahuluan Gen homeodomain leucin zipper HD-Zip menyandikan protein faktor transkripsi yang unik pada tanaman. Protein ini dikenali dengan adanya homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang diperlukan untuk proses dimerisasi. Gen HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah seperti lumut Physcomitrella patens Sakakibara et al. 2001, kemudian pakis Ceratopteris richardii Aso et al. 1999, dan tumbuhan tingkat tinggi seperti Arabidopsis thaliana Hanson et al. 2002; Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004; Kim et al. 2007, kedelai Wang et al. 2005, dan tanaman gurun yang sangat toleran kekeringan Craterostigma plantagienum Deng et al. 2002. Beberapa protein HD-Zip khususnya sub-famili I dilaporkan berperan dalam mengatur perkembangan tanaman dalam merespon kondisi lingkungan seperti kekeringan, suhu ekstrem, stres osmotik, dan kondisi pencahayaan Ariel et al. 2007. Keterlibatan gen dari famili HD-Zip dalam adaptasi kekeringan pada tanaman telah dilaporkan sebelumnya pada tanaman model toleran kekeringan Craterostigma plantagineum dan tanaman model Arabidopsis thaliana Deng et al. 2002, Hjellstrom et al. 2003, Olsson et al. 2004, Dezaar et al. 2005a, Deng et al. 2006. Gen HD-Zip pada tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini Agalou et al. 2008. Sebanyak 8 dari 31 gen HD-Zip sub-famili I, II dan III yang berhasil diungkap pada tanaman padi dilaporkan responsif terhadap kekeringan. Lima 5 gen OsHox4, 6, 20, 22, dan 24 diantaranya merupakan anggota dari kelompok sub-famili I dan 3 gen OsHox11, 19, dan 27 merupakan anggota dari sub-famili II. Gen-gen ini berpotensi sebagai kandidat gen yang menentukan sifat toleran kekeringan yang diperlukan dalam upaya perakitan tanaman toleran kekeringan. Dari 8 gen HD-Zip responsif kekeringan tersebut, baru gen OsHox1 dan Oshox4 padi yang telah dipelajari secara mendetil. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh Scarpella et al. 2000. Agalou et al. 2008 melaporkan bahwa overekspresi gen OsHox4 yang dikendalikan promoter 35S meningkatkan toleransi tanaman padi varietas Nipponbare terhadap kekeringan. Namun, tanaman yang dihasilkan kerdil akibat ukuran sel yang lebih pendek dan steril. Dai et al. 2008 menduga bahwa overekspresi gen OsHox4 mengganggu respon tanaman terhadap hormon giberelin, sehingga menyebabkan tanaman kerdil. Overekspresi gen OsHox4 juga menghambat produksi α-amilase yang tergantung pada giberelin pada saat proses perkecambahan. Hingga saat ini fungsi gen OsHox lainnya pada tanaman padi belum diketahui. Gen OsHox6 adalah salah satu anggota dari faktor transkripsi HD-Zip sub- famili I. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pada tanaman padi ditemukan 1 salinan gen OsHox6 yang terletak pada kromosom 9 Meijer et al. 2000; Agalou et al. 2008. Ekspresi gen OsHox6 meningkat saat ada kekeringan sehingga diduga OsHox6 memiliki peran dalam mekanisme adaptasi terhadap kekeringan Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008 Fungsi OsHox6 dalam merespon cekaman kekeringan belum diketahui sebelumnya. Hasil penelusuran protein OsHox6 pada pangkalan data http:www.uniprot.orguniprot menunjukkan bahwa protein OsHox6 baik pada padi Indica Q9XH35 maupun Japonica Q651Z5 terdiri dari 249 asam amino dengan perkiraan berat molekul 27,3 kDa. OsHox6 diekspresikan pada kecambah, akar, daun, buku, ruas batang, bunga dan embrio Meijer et al. 2000; Agalou et al. 2008. Rekonstruksi filogeni gen HD-Zip dari tanaman monokotil dan dikotil berdasarkan kemiripan sekuen dan organisasi intron-exon menunjukkan bahwa gen OsHox6 pada tanaman padi ortholog dengan gen AtHB7 dan AtHB12 dari Arabidopsis Agalou et al. 2008, gen MtHB1 dari Medicago truncatula dan gen NaHD20 dari tanaman tembakau Nicotiana attenuata Harris et al. 2011. Ortholog adalah gen-gen dari spesies berbeda yang berevolusi dari suatu gen leluhur umum, dan oleh karena itu memiliki fungsi yang sama http:homepage.usask.ca~ctl271857def_homolog.shtml . Penelitian pada Arabidopsis menunjukkan bahwa gen AtHB7 dan AtHB12 dalam proses respon terhadap kekeringan berperan dalam mengatur pemanjangan sel dan pertumbuhan tanaman melalui jalur ABA ABA dependent pathway Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004. Sedangkan NaHD20 menginduksi akumulasi ABA pada tanaman tembakau Re et al. 2010. Pada Medicago truncatula, MtHB1 diinduksi oleh ABA dan berperan dalam menghambat pembentukan akar lateral Ariel et al. 2010. Diduga ada kemiripan fungsi gen OsHox6 dengan AtHB7 dan AtHB12 dari Arabidopsis thaliana, NaHD20 dari tembakau, dan MtHB1 dari Medicago truncatula. Pada Bab ini fungsi gen OsHox6 dipelajari menggunakan tanaman padi transgenik hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Promoter OsLEA3 dilaporkan menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekeringan. Peranan gen OsHox6 tanaman padi dalam merespon cekaman kekeringan dievaluasi dengan melihat persentase recovery tanaman transgenik setelah diberi perlakukan kekeringan selama 14 hari pada fase vegetatif. Bahan dan Metode Bahan Tanaman dan Induksi Kalus Benih padi varietas Ciherang dan IR64 ditanam dan dipelihara di rumah kaca sebagai sumber eksplan embrio benih padi. Embrio benih padi masak susu 10-12 hari setelah anthesis digunakan sebagai bahan untuk induksi kalus. Benih dikupas dan disterilisasi dengan 70 etanol selama satu menit dilanjutkan dengan 2,5 larutan natrium klorida NaClO yang mengandung setetes Tween 20 selama 15 menit. Benih kemudian dicuci beberapa kali dengan air steril untuk menghilangkan larutan NaClO. Embrio dikeluarkan dengan menekan benih menggunakan pinset steril dalam laminar, selanjutnya ditanam pada media induksi kalus lihat Tabel 4 dan disimpan pada kondisi gelap selama 6 hari. Kalus yang berumur 6 hari kemudian digunakan sebagai bahan transformasi. Strain Bakteri dan Plasmid Plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 Gambar 15 diperoleh dari Dr. Pieter B.F. Ouwerkerk Univ. Leiden, Belanda. Di dalam T-DNA plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 dan gen penanda gusA serta gen penyeleksi hpt masing-masing dikontrol oleh promoter 35S CaMV. Gen Gambar 15 T-DNA di dalam pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6. Sepasang primer, forward P1 and reverse P2, digunakan untuk memperbanyak daerah penyandi gen hpt. Fragmen gen hpt 492pb hasil PCR digunakan sebagai pelacak pada analisis Southern. OsHox6 640 pb diisolasi dari padi varietas IR58. Plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 ditransformasi ke dalam sel E.coli DH5 α dengan metode kejut panas untuk perbanyakan. Vector pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6 dimobilisasikan dari E. coli DH5 α ke A. tumefaciens LBA4404 menggunakan metode tri-parental mating dengan bantuan E. coli yang membawa plasmid pRK 2013. DNA plasmid pCAMBIA1301H OsLEA3P::OsHox6, kemudian diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong menggunakan enzim restriksi untuk konfirmasi. Transformasi dan Regenerasi Transformasi dan regenerasi kalus Ciherang dan IR64 dilakukan mengikuti cara kerja seperti yang telah dijelaskan di ‘Bahan dan Metode’ pada Bab III disertasi ini. PCR DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. 2000. Sepasang primer, forward 5-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3 dan reverse 5-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3 digunakan untuk mengampli fikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl sampel DNA, 2,5 pM masing-masing primer, dan 6,5 µl GoTaq ® Green Master Mix Promega dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus dimana denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 o C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis menggunakan 1 gel agarosa. Analisis Southern Blot DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik PCR-positif hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. 1994. Sampel DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya Sambrook et al. 1989. Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen DNA hasil PCR 492 bp menggunakan primer spesifik untuk gen hpt Gambar 15. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection system dari GE Healthcare Amersham Bioscience mengikuti petunjuk produsen. Uji Kekeringan Kecambah umur 1 minggu dari galur T1 terpilih ditumbuhkan dimedia Yoshida mengandung higromisin 50 mgl selama 2 minggu atau hingga semua tanaman kontrol yang tidak ditransformasi mati. Sebagai positif kotrol digunakan tanaman Ciherang homozigot untuk gen hpt yang diperoleh dari percobaan sebelumnya, sedangkan negatif kontrol digunakan tanaman padi IR64 dan Ciherang yang tidak ditransformasi. Tanaman transgenik yang tumbuh normal dipindahkan ke pot yang berisi campuran topsoil, pasir dan cocopeat 2:1:1. Masing-masing pot berisi 12 tanaman, setiap galur terdiri dari 4 pot. Tanaman ditumbuhkan selama dua minggu pada kondisi normal di rumah kaca. Tanaman kemudian dibagi dua perlakuan, dikeringkan dan tidak dikeringkan kontrol. Sehingga untuk setiap galur, satu perlakuan terdiri dari 2 pot. Sebelum perlakuan kekeringan dimulai, tanaman disiram hingga jenuh. Selanjutnya, tanaman dikeringkan tidak disiram selama 14 hari atau hingga tanaman kontrol tipe liar menunjukkan layu kritis atau mati. Kemudian tanaman disiram kembali dan diamati setelah 4 hari disiram kembali. Kadar air tanah pada awal dan akhir percobaan dicatat. Pengamatan terhadap survival rate dilakukan pada hari ke- empat setelah tanaman disiram kembali dan dihitung berdasarkan jumlah tanaman yang segar kembali dibagi jumlah tanaman yang diuji. Selain itu tinggi tanaman diukur 1 minggu setelah disiram kembali, sebelum kemudian dipindahkan ke pot yang lebih besar untuk memperoleh benih generasi berikutnya. Hasil Transformasi dan Analisis Molekuler Tanaman Hasil Transformasi dengan OsLEA3P::OsHox6 Gen OsHox6 padi varietas IR58 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 di transfer ke dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan IR64 menggunakan transformasi Agrobacterium tumefaciens. Untuk memudahkan proses seleksi dan konfirmasi hasil transformasi, gen penanda gus dan penyeleksi hpt yang dikendalikan promoter 35S CaMV juga disertakan dalam T-DNA Gambar 15. Seleksi dilakukan secara ketat sejak fase kalus hingga planlet Gambar 16c, d, f dengan menambahkan masing-masing higromisin 50 mgl pada media seleksi dan pra regenerasi, dan 30 mgl pada media induksi akar ½ MS. Kandidat tanaman transgenik di karakterisasi lebih lanjut dengan PCR dan Southern blot untuk seleksi tanaman positif mengandung transgen dan memilih tanaman dengan salinan gen tunggal. Hasil transformasi terhadap 7101 kalus Ciherang dan 2320 kalus IR64 diperoleh masing-masing 29 dan 11 tanaman konsisten positif PCR hpt. Tanaman positif PCR hpt ini kemudian di Southern. Tanaman positif PCR atau berdasarkan hasil Southern mengandung satu salinan transgen dibiarkan menyerbuk sendiri untuk menghasilkan benih T 1 . Populasi tanaman T 1 selanjutnya digunakan sebagai bahan untuk mengevaluasi segregasi gen hpt berdasarkan analisis PCR. Hasil analisis PCR 29 galur Ciherang hasil transformasi dengan gen OsHox6 diperoleh 4 kandidat galur Ciherang CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197 bersegregasi 3:1 Tabel 11, mengindikasikan penyisipan tunggal. Konfirmasi jumlah salinan gen dengan Southern blot pada tanaman Ciherang masih perlu dilakukan. Selanjutnya, hasil analisis Southern pada 11 tanaman T IR64 positif PCR hpt menunjukkan 6 galur I33, I19, I23, I29, I.31, dan I40 diantaranya memiliki salinan gen tunggal Gambar 17. Berdasarkan hasil analisis PCR dan Southern blot kemudian dipilih sepuluh galur, yaitu 4 galur Ciherang CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197 dan 6 galur IR64 I33, I19, I23, I29, I.31, dan I40, untuk dievaluasi tingkat toleransinya pada kondisi kekeringan. a b c d e g f h i Gambar 16 . Tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman padi varietas Ciherang atau IR64 yang mengandung OsLEA3::OsHox6. a. Kalus yang diinduksi dari immature embrio diinkubasi dengan A. tumefaciens pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6, b. Kalus mengeks presikan β-glucuronidase 6 hari setelah ko-kultivasi dengan A. tumefaciens pCAMBIA 1301H OsLEA3P::OsHox6, c. Kalus tahan higromisin tumbuh aktif pada media seleksi mengandung higromisin 50 mgl, d. Planlet beregenerasi dari kalus tahan higromisin, e. Planlet hasil regenerasi yang mengekspresikan β-glucuronidase, f. Planlet aktif tumbuh pada media induksi perakaran ½ MS yang mengandung higromisin 30 mgl. g. Tanaman T Ciherang hasil transformasi dengan OsHox6 yang dikendalikan promoter OsLEA3, h. Daun tanaman yang mengekspresikan β-glucuronidase, dan i. Uji higromisin pada daun tanaman Ciherang hasil transformasi dengan OsHox6. Tabel 11 Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 Ciherang dan IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3. Varietas Galur Jumlah tanaman T 1 Total tanaman yang diuji PCR + hpt Rasio segregasi X P 2 Ciherang CH.5 15 21 3:1 0,14 0,05 CH.152 18 24 3:1 CH.153 17 26 3:1 1,28 CH.197 13 22 3:1 3,16 IR64 I.19 18 30 3:1 3,60 I.23 20 30 3:1 1,11 I.29 18 30 3:1 3,60 I.31 26 30 3:1 3,18 I.33 20 30 3:1 1,11 I.40 22 30 3:1 0,04 sangat berbeda nyata pada selang kepercayaan 95. X 2 tabel df=1, α0.05 = 3.841 Gambar 17 Hasil hibridisasi Southern DNA tanaman IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6. DNA diisolasi dari daun padi positif PCR hpt. Sampel DNA genom total di potong dengan EcoRI. Produk PCR hasil perbanyakan daerah penyandi gen hpt digunakan sebagai pelacak. M. Marka λ DNA HindIII, 1-12. Sampel DNA IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Kb 23 9 6 4 2,2 2,0 Persentase recovery Survival Rate Tanaman Transgenik Mengandung Ekstra Salinan Gen OsHox6 Sebanyak sepuluh galur, masing-masing 4 galur Ciherang CH.5, CH.152, CH.153, dan CH.197 dan 6 galur IR64 I.33, I.19, I.23, I.29, I.31, dan I.40 diseleksi di media mengandung higromisin 50 mgL -1 sebelum dievaluasi tingkat toleransinya terhadap kekeringan. Semua tanaman kontrol yang tidak ditransformasi tidak ada yang bertahan hidup setelah di kultur selama 2 minggu pada media yang mengandung higromisin 50 mgL -1 , sebaliknya tanaman kontrol positif mengandung dan mengekpresikan hpt tumbuh normal data tidak ditampilkan. Setelah dua minggu ditumbuhkan dimedia seleksi semua tanaman Ciherang yang berdasarkan PCR bersegregasi 3:1 tumbuh terhambat dan kemudian mati. Sebaliknya sebahagian besar tanaman T 1 IR64 tumbuh subur pada media mengandung higromisin 50 mgL -1 Evaluasi tingkat toleransi tanaman transgenik terhadap kekeringan dilakukan dengan tidak menyiram tanaman selama 14 hari. Pada hari ke-14 semua daun tanaman sudah menggulung dan layu akibat kekeringan. Kadar air tanah pada hari ke-14 adalah 9,07 ± 1,96 ∼23 dari kapasitas lapang. Kadar air tanah kapasitas lapang adalah 39,28 ± 6,57 . Setelah disiram kembali sebahagian tanaman segar kembali Gambar 18. . Tanaman toleran higromisin ini kemudian dipindahkan ke dalam pot dan ditumbuhkan selama 2 minggu untuk pemulihan sebelum selanjutnya diuji kekeringan. Tingkat toleran kekeringan dari masing-masing galur dihitung berdasarkan tingkat recovery survival rate tanaman padi umur 5 minggu yang dikeringkan selama 14 hari di rumah kaca, kemudian disiram kembali selama 4 hari sebelum pengamatan. Empat galur, yaitu IR64 I.23, I.40, I. 19, dan I.33 menunjukkan tingkat kelangsungan hidup survival rate yang lebih tinggi dibandingkan dengan tipe liarnya Tabel 12, mengindikasikan bahwa OsHox6 meningkatkan toleransi tanaman padi terhadap cekaman kekeringan. Galur I.19 dan I.23 menunjukkan tingkat recovery paling tinggi 87,5 dilanjutkan oleh galur, I.40, dan I.33 masing-masing dengan recovery 83,3 dan 62,5. Dua galur, yaitu I.31 dan I.29, menunjukkan tingkat recovery yang lebih rendah masing-masing 12,5 dan 0 dari kontrol IR64 yang tidak ditransformasi 41,7.