tumefaciens LBA288 ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIKA PADI MENGGUNAKAN

responsive element ABRE, drought responsive element DRE, myb, myc adalah beberapa elemen cis-acting penting yang banyak dijumpai pada daerah promoter gen terinduksi kekeringan dan bertanggung jawab dalam menginduksi ekspresi gen pada saat tanaman mengalami kondisi keterbatasan air Shen et al. 2004; Chen et al. 2005; Rai et al. 2009. Gen OsHox6 dari padi merupakan anggota dari famili HD-Zip. Purwantomo 2007 dan Agalou et al. 2008 melaporkan bahwa transkrip OsHox6 meningkat pada saat ada induksi kekeringan. Namun, hingga saat ini, belum ada laporan mengenai analisis promoter gen OsHox6. Analisis promoter penting dilakukan untuk mengetahui mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler. Di dalam kegiatan penelitian ini promoter OsHox6 dari padi varietas Ciherang diisolasi dan dipelajari aktivitasnya pada dua tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare. Promoter diisolasi menggunakan pendekatan PCR genomik dengan memanfaatkan informasi yang ada di GenBank. Kandidat promoter kemudian difusikan dengan gen pelapor GUSPlus dan ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi cv Ciherang dan Nipponbare. Aktifitas promoter diamati pada organ vegetatif dan generatif tanaman T menggunakan uji GUS. Selanjutnya, elemen cis-acting terkait kekeringan diprediksi dengan bantuan perangkat lunak PLACE Plant cis-acting regulatory DNA elements http:www.dna.affrc. go.jpPLACE signalscan.html . Bahan dan Metode Bahan Tanaman Promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Oryza sativa L. varietas Ciherang. Fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus ditransformasi ke dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare. Isolasi DNA dan Konstruksi Plasmid DNA genom total diisolasi dari daun padi mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Heusden et al. 2000. Sekuen promoter gen terinduksi kekeringan OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 no. aksesi AF145730 dengan klon BAC APOO5681 NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov . Daerah upstream cDNA OsHox6 sepanjang 1 kb diperbanyak menggunakan sepasang primer PCR, selanjutnya diisolasi dan disub-klon ke dalam vektor pGEM ® -T Easy Promega. Primer forward 5 ′- GCGAATTCTGGTGTATGTGTGGTGTGTGTTC- 3 ′ mengandung situs restriksi EcoRI miring sedangkan primer reverse 5 ′-ATCCATGGCGCCCGATCGAG CTCTGATGATCGATG-3 ′ mengandung situs restriksi NcoI tebal pada daerah ujung 5’nya. Plasmid pGEM ® -T Easy mengandung kandidat DNA sisipan insert selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli strain DH5 α menggunakan metode kejut panas heat shock. Plasmid pGEM-T Easy mengandung kandidat putative promoter OsHox6 diisolasi dari koloni putih positif PCR dan kemudian disekuen untuk menjamin kebenaran hasil isolasi. Urutan DNA diedit secara manual sebelum disejajarkan dengan sekuen DNA acuan BAC clone APOO5681 menggunakan software DNAMAN for Windows versi 4.0.0.1 Lynnon BioSoft. Promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb kemudian dipotong dari pGEM-T Easy menggunakan enzim restriksi EcoRI and NcoI dan kemudian disisipkan ke dalam vektor biner pCAMBIA1305.1 yang telah dipotong dengan enzim yang sama untuk menghilangkan promoter CaMV 35S yang mengontrol gen GUSPlus Gambar 8. Plasmid hasil modifikasi, disebut dengan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diuji untuk konfirmasi DNA sisipan dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi tertentu. Vector pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, selanjutnya, dimobilisasikan dari E. coli DH5 α ke A. tumefaciens EHA 105 menggunakan metode tri-parental mating dengan bantuan E. coli yang membawa plasmid pRK 2013. DNA plasmid pCAMBIA 1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu untuk konfirmasi. Transformasi Padi Transformasi padi varietas Ciherang dan Nipponbare dilakukan pada kalus yang diinduksi dari embrio padi belum masak dengan bantuan A. tumefaciens mengikuti protokol yang telah dijelaskan pada Bab III. Gambar 8 Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus a. Vektor biner pCAMBIA1305.1 digunakan sebagai vektor dasar. Promoter OsHox6 1kb disisipkan ke dalam pCAMBIA1305.1 menggantikan promoter 35S untuk menghasilkan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus. b. Gambaran proses kloning pada agarose gel elektroforesis. Kolom: 1. Hasil perbanyakan PCR promoter OsHox6 dengan ukuran 1 kb, 2- 3 . Vektor pGEM-T Easy mengandung promoter OsHox6 1 kb dipotong dengan EcoRI and NcoI untuk melepas promoter sisipan, 4- 5 dan 11. Vektor pCAMBIA1305.1 dipotong dengan enzim EcoRI and NcoI untuk menghasilkan gen GUSPlus tanpa promoter, 6-10 pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong dengan EcoRI and NcoI, M 1 . Marka DNA λ HindIII , M 2 . 100bp DNA ladder. PCR DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. 2000. Sepasang primer, forward 5-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3 dan reverse 5-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ digunakan untuk mengam- plifikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl sampel DNA, 6,25 µM masing-masing primer, dan 6,5 µl KAPA Taq ReadyMix a b PCR Kit KAPA Biosystems dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1 menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72 o C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis mengunakan 0.8 gel agarosa. Analisis Southern Blot DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik positif PCR hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. 1994. Sampel DNA dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya Sambrook et al. 1989. Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen DNA hasil PCR 492 bp yang diperbanyak menggunakan primer spesifik untuk gen hpt. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection system dari GE Healthcare Amersham Bioscience mengikuti petunjuk produsen. Induksi Kekeringan Induksi kekeringan diberikan pada fase vegetatif dan generatif tanaman T positif PCR hpt dengan 2 pendekatan. Pendekatan pertama, induksi kekeringan dilakukan dengan cepat yaitu dengan mengering anginkan sampel di atas kertas seperti yang dilakukan Gao et al. 2011 selama 1 jam. Tanaman yang tidak dikeringkan digunakan sebagai kontrol. Kedua, kekeringan dilakukan secara lambat dimana tanaman ditanam pada pipa paralon PVC mengikuti metode yang dijelaskan oleh Yue et al. 2006. Tanaman ditanam masing-masing satu tanaman per paralon. Tanaman disiram setiap hari. Pada saat perlakuan kekeringan air pada pipa dibuang melalui lubang yang ada di bagian bawah pipa, dan tidak disiram selama percobaan kekeringan dilakukan hingga 50 dari tanaman menunjukkan gejala daun menggulung. Sampel daun, akar, batang, bunga diambil sebelum perlakuan hari ke 0, kemudian pada hari ke 2, 4, 6, 7 hari setelah pengeringan, dan 1 hari setelah disiram kembali. Tanaman yang tidak ditransformasi dan yang ditransformasi dengan pCAMBIA1305.1 digunakan sebagai pembanding. Kadar air relatif daun di ukur pada awal dan akhir percobaan kekeringan mengikuti persamaan berikut: Kadar air relatif = [berat segar – berat keringberat turgid-berat kering] x 100 Uji Aktivitas GUS Tanaman T Analisis histokimia GUS dilakukan untuk mempelajari pola ekspresi gen GUSPlus pada tanaman padi yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Organ tanaman daun, batang, akar, bunga direndam dalam larutan X-Gluc 2 mM X- Gluc, 1 mM potassium ferrisianida, 1 mM potassium ferrosianida, 100 µgml chloramphenicol, 10 mM Na Transgenik 2 EDTA.2H 2 O, 0,1 triton-X, 20 metanol dan 50mM dapar sodium fosfat pH 7 disimpan pada suhu 37 o C selama 36 jam pada kondisi gelap. Selanjutnya organ tanaman dicuci dengan tiga seri larutan etanol 50,70, dan 95 vv hingga pigmen klorofil hilang. Jaringan kemudian diamati di bawah mikroskop. Pembuatan Preparat Jaringan Jaringan yang telah diwarnai secara histokimia disayat secara melintang dan membujur menggunakan mikrotom beku freeze mikrotom tipe Yamato RV 240 dengan tebal 15 mikron. Hasil sayatan disusun pada suatu gelas objek dan ditetesi dengan gliserin sebelum ditutup dengan gelas penutup. Sampel diamati menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i. Hasil Identifikasi, Karakterisasi dan Isolasi Promoter OsHox6 Kandidat promoter OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 no. aksesi AF145730 dengan klon BAC APOO5681 NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov . Motif atau cis-acting elemen yang terdapat pada daerah 5’ dari gen terinduksi kekeringan OsHox6 diprediksi dengan bantuan PLACE Plant cis-acting regulatory DNA elements http:www.dna.affrc.go.jp PLACEsignalscan.html . Berdasarkan keberadaan cis-regulatory element dan untuk kemudahan isolasi PCR dan konfirmasi sekuensing selanjutnya dipilih 1 kb daerah upstream dari kodon ATG gen OsHox6 untuk analisis fungsi. Daerah promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb ini diprediksi mengandung 8 kandidat cis- regulatory element terkait respon kekeringan, yaitu motif yang mirip dengan MYB1 dan MYC dari Arabidopsis thaliana, ABRE likeERD1, ERD1, dan LTRE Gambar 9; Tabel 10. Selain itu elemen lain ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2 yang terkait dengan respon terhadap ABA juga ditemukan. Berdasarkan data ini maka promoter OsHox6 diduga responsive terhadap kekeringan dan ABA. Namun, berdasarkan hasil analisis prediksi ini promoter OsHox6 tidak memiliki TATA box yang umum dijumpai pada promoter sel eukaryot. Selanjutnya promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Ciherang menggunakan sepasang primer yang spesifik. Urutan DNA kandidat promoter hasil isolasi dari daun padi kultivar Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat tinggi identity 100 dengan sekuen DNA acuan BAC clone APOO5681 dari Nipponbare Gambar 10. Kloning, Konstruksi Plasmid dan Transformasi Tanaman Padi Kandidat promoter OsHox6 1 kb yang diisolasi dari padi cv Ciherang difusikan dengan gen GUSPlus plasmid pCAMBIA 1305.1 yang telah dihilangkan promoter CaMV35S-nya Gambar 8. Vektor pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi Nipponbare dan Ciherang dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens EHA105. Vektor pCAMBIA yang membawa gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter CaMV35S digunakan sebagai positif kontrol, sedangkan tanaman yang tidak ditransformasi digunakan sebagai negatif kontrol. Tiga 3 tanaman Ciherang dan tiga puluh dua 32 tanaman Nipponbare kandidat transgenik berhasil diperoleh. Tanaman transgenik di PCR dan Southern untuk konfirmasi keberadaan transgen menggunakan pelacak gen hpt. Hasil PCR menunjukkan, secara berturut-turut, 30 dan 1 tanaman Nipponbare dan Ciherang, positif PCR hpt Gambar 11. Sebanyak 12 tanaman Nipponbare positif PCR hpt di Southern menggunakan pelacak hpt. Enam tanaman Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6, mengandung satu salinan gen hpt data tidak ditampilkan, meyakinkan bahwa gen telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Tanaman yang mengandung satu salinan gen GUSPlus ini kemudian digunakan untuk analisis selanjutnya untuk mempelajari pola ekspresi gen GusPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Gambar 9 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter OsHox6. Informasi lebih lanjut dari masing-masing cis-acting elemen dirangkum pada Tabel 10. Tabel 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb daerah promoter OsHox6. Nama cis- elemen Sekuen cis-elemen Jumlah cis- elemen Posisi Keterangan Pustaka ABRE likeERD1 ACGTG 1 -348 etiolation-induced expression of erd1 early responsive to dehydration Simpson et al. 2003 AtACGT ERD1 ACGT 3 -349, 361 -568 etiolation-induced expression of erd1 early responsive to dehydration Simpson et al. 2003 HvCBF RYCGAC 1 -384 dehydration-responsive element DRE binding proteins DREBs Xue 2002 LTRE CCGAC 1 -572 Cold, drought, ABA responsive element Baker et al. 1994 AtMYB1 WAACCA 1 -583 ABA, dehydration responsive Abe et al. 2003 AtMYC ERD1 CATGTG 1 -978 Water stress Tran et al. 2004 CGCG BOX VCGCGB 19 -248 -795 dst Ca++Calmodulin binding Yang Poovaiah 2002 ABRE related sequence MACGYG B 2 -630 -795 Ca++ responsive Kaplan et al. 2006 SORLIP1 GCCAC 8 -127 -643 dst Phytochrome A-induced motifs Jiao et al. 2005 SORLIP2 GGGCC 2 -177 -839 Phytochrome A-induced motifs Hudson Quail 2003 TATA Box TATAA Grace et al. 2004 R adalah nukleotida A atau G, Y nukleotida C atau T, dan W nucleotida A atau T, V nukleotida

A, C, atau G, B nukleotida C, G, atau T, dan M nukleotida A atau C.