tumefaciens LBA288 ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIKA PADI MENGGUNAKAN
responsive element ABRE, drought responsive element DRE, myb, myc adalah beberapa elemen cis-acting penting yang banyak dijumpai pada daerah promoter
gen terinduksi kekeringan dan bertanggung jawab dalam menginduksi ekspresi gen pada saat tanaman mengalami kondisi keterbatasan air Shen et al. 2004;
Chen et al. 2005; Rai et al. 2009. Gen OsHox6 dari padi merupakan anggota dari famili HD-Zip.
Purwantomo 2007 dan Agalou et al. 2008 melaporkan bahwa transkrip OsHox6 meningkat pada saat ada induksi kekeringan. Namun, hingga saat ini,
belum ada laporan mengenai analisis promoter gen OsHox6. Analisis promoter penting dilakukan untuk mengetahui mekanisme regulasi proses transkripsi gen
pada level molekuler. Di dalam kegiatan penelitian ini promoter OsHox6 dari padi varietas
Ciherang diisolasi dan dipelajari aktivitasnya pada dua tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare. Promoter diisolasi menggunakan pendekatan PCR
genomik dengan memanfaatkan informasi yang ada di GenBank. Kandidat promoter kemudian difusikan dengan gen pelapor GUSPlus dan ditransformasikan
ke dalam genom tanaman padi cv Ciherang dan Nipponbare. Aktifitas promoter diamati pada organ vegetatif dan generatif tanaman T
menggunakan uji GUS. Selanjutnya, elemen cis-acting terkait kekeringan diprediksi dengan bantuan
perangkat lunak PLACE Plant cis-acting regulatory DNA elements
http:www.dna.affrc. go.jpPLACE signalscan.html .
Bahan dan Metode Bahan Tanaman
Promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Oryza sativa L. varietas Ciherang. Fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus ditransformasi ke
dalam genom tanaman padi varietas Ciherang dan Nipponbare.
Isolasi DNA dan Konstruksi Plasmid
DNA genom total diisolasi dari daun padi mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Heusden et al. 2000. Sekuen promoter gen terinduksi kekeringan
OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 no. aksesi
AF145730 dengan klon BAC APOO5681 NCBI
http:www.ncbi.nlm.nih.gov .
Daerah upstream cDNA OsHox6 sepanjang 1 kb diperbanyak menggunakan sepasang primer PCR, selanjutnya diisolasi dan disub-klon ke dalam vektor
pGEM
®
-T Easy Promega. Primer forward
5 ′-
GCGAATTCTGGTGTATGTGTGGTGTGTGTTC- 3
′ mengandung situs restriksi
EcoRI miring sedangkan primer reverse 5 ′-ATCCATGGCGCCCGATCGAG
CTCTGATGATCGATG-3 ′
mengandung situs restriksi NcoI tebal pada daerah
ujung 5’nya. Plasmid pGEM
®
-T Easy mengandung kandidat DNA sisipan insert selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli strain DH5
α menggunakan metode kejut panas heat shock. Plasmid pGEM-T Easy
mengandung kandidat putative promoter OsHox6 diisolasi dari koloni putih positif PCR dan kemudian disekuen untuk menjamin kebenaran hasil isolasi.
Urutan DNA diedit secara manual sebelum disejajarkan dengan sekuen DNA acuan BAC clone APOO5681 menggunakan software DNAMAN for Windows
versi 4.0.0.1 Lynnon BioSoft. Promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb kemudian dipotong dari pGEM-T Easy menggunakan enzim restriksi EcoRI and NcoI dan
kemudian disisipkan ke dalam vektor biner pCAMBIA1305.1 yang telah dipotong dengan enzim yang sama untuk menghilangkan promoter CaMV 35S yang
mengontrol gen GUSPlus Gambar 8. Plasmid hasil modifikasi, disebut dengan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diuji untuk konfirmasi
DNA sisipan dengan memotong plasmid menggunakan enzim restriksi tertentu. Vector pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus, selanjutnya, dimobilisasikan dari
E. coli DH5 α ke A. tumefaciens EHA 105 menggunakan metode tri-parental
mating dengan bantuan E. coli yang membawa plasmid pRK 2013. DNA plasmid pCAMBIA 1305.1 OsHox6P::GUSPlus, kemudian diisolasi dari A. tumefaciens
dan dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu untuk konfirmasi.
Transformasi Padi
Transformasi padi varietas Ciherang dan Nipponbare dilakukan pada kalus yang diinduksi dari embrio padi belum masak dengan bantuan A. tumefaciens
mengikuti protokol yang telah dijelaskan pada Bab III.
Gambar 8 Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6
dengan gen pelapor GUSPlus a. Vektor biner pCAMBIA1305.1 digunakan sebagai vektor dasar. Promoter OsHox6 1kb disisipkan
ke dalam pCAMBIA1305.1 menggantikan promoter 35S untuk menghasilkan plasmid pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus. b.
Gambaran proses kloning pada agarose gel elektroforesis. Kolom: 1.
Hasil perbanyakan PCR promoter OsHox6 dengan ukuran 1 kb, 2- 3
. Vektor pGEM-T Easy mengandung promoter OsHox6 1 kb
dipotong dengan EcoRI and NcoI untuk melepas promoter sisipan, 4- 5
dan 11. Vektor pCAMBIA1305.1 dipotong dengan enzim EcoRI and NcoI untuk menghasilkan gen GUSPlus tanpa promoter, 6-10
pCAMBIA1305.1 OsHox6P::GUSPlus diisolasi dari A. tumefaciens dan dipotong dengan EcoRI and NcoI, M
1
. Marka DNA
λ
HindIII
, M
2
.
100bp DNA ladder.
PCR
DNA diekstraksi dari daun seperti yang dijelaskan oleh Heusden et al. 2000. Sepasang primer, forward 5-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3 dan
reverse 5-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ digunakan untuk mengam- plifikasi daerah penyandi gen hpt. Reaksi perbanyakan gen hpt adalah 1 µl
sampel DNA, 6,25 µM masing-masing primer, dan 6,5 µl KAPA Taq ReadyMix
a
b
PCR Kit KAPA Biosystems dan air hingga mencapai total reaksi 12,5 µl. Perbanyakan DNA dilakukan dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus
denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 3 menit, 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, annealing pada suhu 60 ºC selama 1
menit dan perpanjangan pada 72 ºC selama 1 menit, dan satu siklus polimerisasi DNA pada suhu 72
o
C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan dengan elektrophoresis mengunakan 0.8 gel agarosa.
Analisis Southern Blot
DNA genom total diekstrak dari daun segar tanaman transgenik positif PCR hpt seperti yang dijelaskan oleh Lodhi et al. 1994. Sampel DNA dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI. Southern blot dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya Sambrook et al. 1989. Sebagai pelacak gen hpt digunakan fragmen
DNA hasil PCR 492 bp yang diperbanyak menggunakan primer spesifik untuk gen hpt. Pelacak dilabel dan dideteksi dengan Alkphos labelling and detection
system dari GE Healthcare Amersham Bioscience mengikuti petunjuk produsen.
Induksi Kekeringan
Induksi kekeringan diberikan pada fase vegetatif dan generatif tanaman T positif PCR hpt dengan 2 pendekatan. Pendekatan pertama, induksi kekeringan
dilakukan dengan cepat yaitu dengan mengering anginkan sampel di atas kertas seperti yang dilakukan Gao et al. 2011 selama 1 jam. Tanaman yang tidak
dikeringkan digunakan sebagai kontrol. Kedua, kekeringan dilakukan secara lambat dimana tanaman ditanam pada pipa paralon PVC mengikuti metode yang
dijelaskan oleh Yue et al. 2006. Tanaman ditanam masing-masing satu tanaman per paralon. Tanaman disiram setiap hari. Pada saat perlakuan kekeringan air
pada pipa dibuang melalui lubang yang ada di bagian bawah pipa, dan tidak disiram selama percobaan kekeringan dilakukan hingga 50 dari tanaman
menunjukkan gejala daun menggulung. Sampel daun, akar, batang, bunga diambil sebelum perlakuan hari ke 0, kemudian pada hari ke 2, 4, 6, 7 hari
setelah pengeringan, dan 1 hari setelah disiram kembali. Tanaman yang tidak ditransformasi dan yang ditransformasi dengan pCAMBIA1305.1 digunakan
sebagai pembanding. Kadar air relatif daun di ukur pada awal dan akhir percobaan kekeringan mengikuti persamaan berikut: Kadar air relatif =
[berat segar – berat keringberat turgid-berat kering] x 100
Uji Aktivitas GUS Tanaman T
Analisis histokimia GUS dilakukan untuk mempelajari pola ekspresi gen GUSPlus pada tanaman padi yang dikendalikan oleh promoter OsHox6. Organ
tanaman daun, batang, akar, bunga direndam dalam larutan X-Gluc 2 mM X- Gluc, 1 mM potassium ferrisianida, 1 mM potassium ferrosianida, 100 µgml
chloramphenicol, 10 mM Na
Transgenik
2
EDTA.2H
2
O, 0,1 triton-X, 20 metanol dan 50mM dapar sodium fosfat pH 7 disimpan pada suhu 37
o
C selama 36 jam pada kondisi gelap. Selanjutnya organ tanaman dicuci dengan tiga seri larutan etanol
50,70, dan 95 vv hingga pigmen klorofil hilang. Jaringan kemudian diamati di bawah mikroskop.
Pembuatan Preparat Jaringan
Jaringan yang telah diwarnai secara histokimia disayat secara melintang dan membujur menggunakan mikrotom beku freeze mikrotom tipe Yamato RV 240
dengan tebal 15 mikron. Hasil sayatan disusun pada suatu gelas objek dan ditetesi dengan gliserin sebelum ditutup dengan gelas penutup. Sampel diamati
menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 80i.
Hasil Identifikasi, Karakterisasi dan Isolasi Promoter OsHox6
Kandidat promoter OsHox6 diidentifikasi dengan mensejajarkan cDNA utuh gen OsHox6 no. aksesi AF145730
dengan klon BAC APOO5681 NCBI http:www.ncbi.nlm.nih.gov
. Motif atau cis-acting elemen yang terdapat pada daerah 5’ dari gen terinduksi kekeringan OsHox6 diprediksi dengan bantuan
PLACE Plant cis-acting regulatory DNA elements http:www.dna.affrc.go.jp
PLACEsignalscan.html . Berdasarkan keberadaan cis-regulatory element dan
untuk kemudahan isolasi PCR dan konfirmasi sekuensing selanjutnya dipilih 1 kb daerah upstream dari kodon ATG gen OsHox6 untuk analisis fungsi. Daerah
promoter OsHox6 yang berukuran 1 kb ini diprediksi mengandung 8 kandidat cis- regulatory element terkait respon kekeringan, yaitu motif yang mirip dengan
MYB1 dan MYC dari Arabidopsis thaliana, ABRE likeERD1, ERD1, dan LTRE Gambar 9;
Tabel 10. Selain itu elemen lain ABRE related sequences, CGCG Box, SORLIP1 dan SORLIP2 yang terkait dengan respon terhadap ABA juga
ditemukan. Berdasarkan data ini maka promoter OsHox6 diduga responsive terhadap kekeringan dan ABA. Namun, berdasarkan hasil analisis prediksi ini
promoter OsHox6 tidak memiliki TATA box yang umum dijumpai pada promoter sel eukaryot. Selanjutnya promoter OsHox6 diisolasi dari tanaman padi Ciherang
menggunakan sepasang primer yang spesifik. Urutan DNA kandidat promoter hasil isolasi dari daun padi kultivar Ciherang menunjukkan kemiripan yang sangat
tinggi identity 100 dengan sekuen DNA acuan BAC clone APOO5681 dari Nipponbare Gambar 10.
Kloning, Konstruksi Plasmid dan Transformasi Tanaman Padi
Kandidat promoter OsHox6 1 kb yang diisolasi dari padi cv Ciherang difusikan dengan gen GUSPlus plasmid pCAMBIA 1305.1 yang telah dihilangkan
promoter CaMV35S-nya Gambar 8. Vektor pCAMBIA1305.1
OsHox6P::GUSPlus ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi Nipponbare dan Ciherang dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens EHA105. Vektor
pCAMBIA yang membawa gen GUSPlus yang dikendalikan oleh promoter CaMV35S digunakan sebagai positif kontrol, sedangkan tanaman yang tidak
ditransformasi digunakan sebagai negatif kontrol. Tiga 3 tanaman Ciherang dan tiga puluh dua 32 tanaman Nipponbare kandidat transgenik berhasil diperoleh.
Tanaman transgenik di PCR dan Southern untuk konfirmasi keberadaan transgen menggunakan pelacak gen hpt. Hasil PCR menunjukkan, secara
berturut-turut, 30 dan 1 tanaman Nipponbare dan Ciherang, positif PCR hpt Gambar 11. Sebanyak 12 tanaman Nipponbare positif PCR hpt di Southern
menggunakan pelacak hpt. Enam tanaman Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6, mengandung satu salinan
gen hpt data tidak ditampilkan, meyakinkan bahwa gen telah terintegrasi ke dalam genom tanaman. Tanaman yang mengandung satu salinan gen GUSPlus ini
kemudian digunakan untuk analisis selanjutnya untuk mempelajari pola ekspresi gen GusPlus yang dikendalikan oleh promoter OsHox6.
Gambar 9 Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter
OsHox6. Informasi lebih lanjut dari masing-masing cis-acting elemen dirangkum pada Tabel 10.
Tabel 10 Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb
daerah promoter OsHox6.
Nama cis-
elemen Sekuen
cis-elemen Jumlah
cis- elemen
Posisi Keterangan
Pustaka
ABRE likeERD1
ACGTG 1
-348 etiolation-induced
expression of erd1 early responsive to dehydration
Simpson et al. 2003
AtACGT ERD1
ACGT 3
-349, 361
-568 etiolation-induced
expression of erd1 early responsive to dehydration
Simpson et al. 2003
HvCBF RYCGAC
1 -384
dehydration-responsive element DRE binding
proteins DREBs Xue 2002
LTRE CCGAC
1 -572
Cold, drought, ABA responsive element
Baker et al. 1994
AtMYB1 WAACCA
1 -583
ABA, dehydration responsive
Abe et al. 2003
AtMYC ERD1
CATGTG 1
-978 Water stress
Tran et al. 2004
CGCG BOX
VCGCGB 19
-248 -795
dst Ca++Calmodulin binding
Yang Poovaiah 2002
ABRE related sequence
MACGYG B
2 -630
-795 Ca++ responsive
Kaplan et al. 2006
SORLIP1 GCCAC
8 -127
-643 dst
Phytochrome A-induced motifs
Jiao et al. 2005
SORLIP2 GGGCC
2 -177
-839 Phytochrome A-induced
motifs Hudson
Quail 2003 TATA Box
TATAA Grace et al.
2004
R adalah nukleotida A atau G, Y nukleotida C atau T, dan W nucleotida A atau T, V nukleotida