PENDAHULUAN Genetic transformation of rice using rhizobium and agrobacterium and functional analysis of OsHox6 Gene

memprediksi padi mengandung ∼32.000 gen. Jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan prediksi sebelumnya 30-50 ribu gen oleh Goff et al. 2002. Sebanyak 28.469 cDNA utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86 diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data Rice Full-Length cDNA Consortium 2003. Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut. Cekaman Kekeringan Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata Kalsim 2007. Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan Setter et al. 1995. Fase generatif merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan Yue et al. 2006. Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso. Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan Naylor et al. 2007. Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim. Untuk dapat merakit padi toleran kekeringan diperlukan pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada tanaman. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada level molekuler sangat penting dilakukan. Data hasil kajian yang telah berhasil diperoleh hingga saat ini dapat dijadikan sebagai dasar di dalam upaya memahami sifat toleran kekeringan pada tanaman padi, dan juga pada tanaman sereal lainnya. Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010. Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya Fukai Cooper 1995 atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan Price et al. 2002. Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. Oleh karena itu untuk mengatasi cekaman lingkungan yang tidak menguntungkan, tanaman mengembangkan suatu mekanisme toleransi Levit 1980; Mundree et al. 2002. Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman. Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein Takahashi et al. 2000. Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mRNA, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino Foyer et al. 1998. Secara umum mekanisme yang dikembangkan oleh tumbuhan untuk mengatasi cekaman lingkungan kekeringan dikelompokkan ke dalam tiga kelompok Levit 1980; Chaves et al. 2003, yaitu escape, penghindaran avoidance, dan toleran. Mekanisme adaptasi tanaman ini tidak saling terpisah. Suatu tanaman dapat menggabungkan berbagai mekanisme yang berbeda untuk proses adaptasi terhadap cekaman Ludlow 1989, diacu dalam Chavez et al. 2003. Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011, differential display RT-PCR Medini et al. 2009, cDNA AFLP Gao et al. 2009, dan DNA microarray Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011. Seki et al. 2001 mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cDNA microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya rd29Acor78, cor15a, kin1, kin2, rd17cor47, erd10, dan rd20, sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. 2002 mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan. Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. 2003 mengamati 1700 cDNA tanaman padi menggunakan cDNA microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. 2009 membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah. Berdasarkan pengaturan ekspresinya Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki 1997 membagi gen terinduksi kekeringan ke dalam dua kelompok, yaitu yang ekspresinya diinduksi oleh ABA ABA-dependent dan tidak diinduksi ABA ABA-independent. Berdasarkan fungsinya, Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki 2007 membagi produk dari gen-gen ini ke dalam 2 grup, yaitu: protein fungsional dan protein regulator. Protein fungsional meliputi protein yang berperan dalam merespon kekeringan misalnya protein yang berperan sebagai protease, water channel atau transporter, enzim detoksifikasi, protein faktor makromolekul, LEA protein dan Chaperon, dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit prolin, gula. Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA. Menurut Cushman dan Bohnert 2000 setidaknya ada 8 kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies ROS, protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1. Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial. Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan Nakashima Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008. Oleh karena itu akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa genetika diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan Bhatnagar- Mathur et al. 2008. Faktor Transkripsi Faktor transkripsi, disebut juga faktor pengikat sekuen DNA tertentu sequence-specific DNA-binding factor, adalah suatu protein yang menempel pada urutan DNA tertentu dan mengatur proses transkripsi satu atau lebih gen. Sejak sekuen lengkap genom beberapa tanaman berhasil diungkap, faktor transkripsi dapat diidentifikasi dengan lebih mudah menggunakan kajian Tabel 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Kelompok Fungsi Kemungkinan mekanisme Produk Gen Osmo protektan Penyesuaian osmotic osmotic adjustment; perlindungan atau stabilisasi membrane protein, pemusnah reactive OH- • Asam amino prolin, ektoin • Senyawa dimetil sulfonium glisin betain, DMSP • Polyol mannitol, D-ononitol, sorbitol • Gula sucrose, trehalose, fruktan • Dadc Capel et al. 2004, ectABC Nakayama et al. 2000, AtP5CS Yamada et al. 2005 • CMO Shirasawa et al. 2006 • mtlD Karakas et al. 1997, IMT1 Sheveleva et al. 1997 • OtsA, OtsB Garg et al. 2002 Reactive oxygen scavengers Detoksifikasi spesies oksigen reaktif ROS • Enzim catalase, FeMn superoxide dismutase, askorbat peroksidase, enzim siklus glutation, glutathione S- transferase, glutation peroksidase, gamma- glutamilsistein sintetase, alternative oksidase • Non enzim askorbat, flavon, karotenoid, antosianin chlCUZN SOD Chatzidimitriadou et al. 2009, PpAPX Li et al. 2009, SOD, APX Lu et al. 2010, Eltayeb et al. 2007 Protein stres Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon Protein LEA late embryogenesis abundant ; mis. dehidrin HaDhn1,2 Cellier et al. 1998, OsLEA3-1 Xiao et al. 2007 Status air Tingkah laku stomata, pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma Aquaporin atau lubang channel air OsPIP2-2 Guo et al. 2006 Komponen sinyal Transduksi sinyal yang dimediasi oleh sensor Ca 2+ Homolog histidin kinase AtRR12, MAP kinase PsMAPK, HOG, Ca fosforilasi 2+ SNF1kinase, protein fosfatase ABI12, system sinyal CANB,Ca dependent protein kinase, 2+ inositol kinase sensor SOS3, OsMPK5 Xiong Yang 2003, OsSIK1 Ouyang et al. 2010. Kontrol transkripsi Pengaktifan transkripsi Faktor transkripsi famili: APETELA2 AP2, bZIP, zinc- finger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip • OsDREB1 Ito et al. 2006 • OsbZIP23 Xiang et al. 2008 • WRKY11 Wu et al. 2009, • OsMyb4 Mattana et al. 2005 • SNAC1 Hu et al. 2006 • Hahb4 Dezar et al. 2005a Pengatur pertumbuh an Perubahan homeostasis hormon Mengubah jalur biosintesis atau level konjugat ABA, sitokinin danatau brassinosteroid ARR4 and ARR5 Miyata et al. 1998 OsRR6 Jain et al. 2006 bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya binding domain Zhang et al. 2011. Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bZip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masing- masing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan Family Gen Mekanisme Pustaka AP2ERF DREB CBF4 HARDY GmERF3 SHN1WIN1 Biosintesa osmoprotectan, protein LEA, pengaturan pertumbuhan Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air WUE Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin Ito et al. 2006; Lopato Langridge 2011 Haake et al. 2002 Karaba et al. 2007 Zhang et al. 2009 Aharoni et al. 2004 C2H2 Zinc Finger dst Pengaturan stomata Huang et al. 2009 WRKY BhWRKY1 Signaling oligosakarida famili rafinosa Wang et al. 2009 NF-YA NFYA5 Pengaturan stomata Li et al. 2008, Cominelli et al. 2010 MYB MYB96 AtMYB60 Pengaturan lapisan lilin kutikula Pengaturan stomata Seo et al. 2011 Cominelli et al. 2005 NAC SNAC ONAC045 Pengaturan stomata Hu et al. 2006 Zheng et al. 2009 bZip PtrABF Scavenging ROS Huang et al. 2010 HD-Zip Hahb4 Pengaturan perpanjangan sel atau pertumbuhan Dezar et al. 2005a HD-Zip HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain HD dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA. Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut Sakakibara et al. 2001, paku Aso et al. 1999, hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar Populus tricocarpa Robischon et al. 2011, dari kelas monokotil seperti padi Agalou et al. 2008 dan jagung Whipple et al. 2011, maupun dikotil misalnya Arabidopsis Henriksson et al. 2005, bunga matahari Manavella et al. 2008, dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum Deng et al. 2002, tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung. Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi http:planttfdb.cbi. pku.edu.cn Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya pada berbagai tanaman menunjukkan gen HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam Tabel 3. Beberapa protein HD-Zip yang terkenal adalah GLABRA dari sub-famili IV dan PHABULOSA, CORONA dan REVOLUTA dari sub-famili III. Gen GLABRA penting dalam pembentukan trikoma Rerie et al. 1994, sedangkan gen REVOLUTA, PHABULOSA dan CORONA berperan dalam perkembangan daun, jaringan pembuluh dan inisiasi jaringan meristem Prigge et al. 2005. Akhir-akhir ini gen dari faktor transkripsi HD-Zip khususnya sub-famili I dan II banyak dipelajari terkait respon kekeringan. Pada tanaman gurun yang sangat . Pada Arabidopsis thaliana, misalnya, terdapat 56 gen HD-Zip, kemudian pada bunga matahari ada 15, sedangkan pada padi Indica dan pada padi Japonica secara berturut-turut adalah 46 dan 61 Zhang et al. 2011. Gen HD-Zip ini dibagi kedalam empat sub-famili I-IV berdasarkan empat kriteria, yaitu; 1 konservasi domain HD-Zip yang menggambarkan spesifisitas pengikatan DNA, 2 struktur gen, 3 motif conserved tambahan, dan 4 berdasarkan fungsinya Ariel et al. 2007. Perbedaan struktur protein dari masing-masing sub-famili diilustrasikan pada Gambar 2. toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip CpHB3, 4, 5, 6, 7 responsif kekeringan Deng et al. 2002. Sebelumnya, Frank et al. 1998 telah mengisolasi 2 gen HD-Zip CpHB1 2 responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi. Empat AtHB5, 6, 7, dan 12 diantaranya responsif terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 Ariel et al. 2007. Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004, namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. 2005a menggunakan gen Hahb-4 HD-Zip sub-famili I bunga matahari. Overekspresi Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya. Hal ini menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang. Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. 2008 berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27 dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 padi sawah sensitif kekeringan dan IRAT109 padi gogo toleran kekeringan berdasarkan hasil analisis ekspresi menggunakan real-time PCR. Overekspresi OsHox4 menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Namun, tanaman menjadi kerdil akibat ukuran sel yang pendek dan steril Agalou et al. 2008. Hal ini mengindikasikan bahwa OsHox4 berperan dalam pemanjangan sel. Fungsi gen responsif kekeringan OsHox lainnya belum diketahui, sehingga analisis fungsi gen OsHox masih perlu dilakukan. Gambar 2 Skema struktur protein unik dari setiap sub-famili HD-Zip. HD homeodomain, LZ leucin zipper, CPSCE asam amino konservatif Cys, Pro, Ser, Cys, Glu dengan sandi satu huruf, domain MEKHLA asam amino konservatif Met, Glu, Lys, His, Leu, Ala , N-term consensus ujung-N, SAD START-adjacent domain, START steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer Ariel et al. 2007. Tabel 3 Sub-famili HD-Zip dan fungsinya Sub-famili Fungsi HD-Zip I Respon terhadap cekaman abiotik , respon terdap ABA, de-etiolasi, sinyal cahaya biru HD-Zip II Respon terhadap keadaan pencahayaan,toleran naungan Shade avoidance, respon terhadap auxin HD-Zip III Embriogenesis, pengaturan meristem, inisiasi organ lateral, polaritas daun, perkembangan jaringan pembuluh, transport auxin HD-Zip IV Differensiasi sel epidermis, akumulasi antosianin, perkembangan akar, pembentukan trikom Sumber: Ariel et al. 2007 Analisis Fungsi Gen Tujuan jangka panjang dari proyek sekuensing genom adalah diketahuinya fungsi setiap gen yang ada di dalam genom dan bagaimana interaksinya dengan gen lain. Data ini sangat penting dalam memahami biologi tanaman pada level molekuler dan untuk memuliakan tanaman pada masa mendatang. Secara umum ada 2 pendekatan untuk melakukan analisis fungsi gen, yaitu dengan pendekatan forward dan reverse genetic Peters et al. 2003. Forward genetic adalah pendekatan yang digunakan untuk mengidentifikasi gen yang bertanggung jawab menentukan fenotipe tertentu dalam suatu organisme. Sebaliknya reverse genetic meliputi pendekatan yang digunakan untuk mengetahui fenotipe dari suatu gen tertentu.