Kemudian diinkubasikan dalam shaker 150 rpm pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Pembacaan hasil percobaan didasarkan pada keruh atau tidaknya sumuran percobaan dibandingkan kontrol untuk
menentukan MIC dan juga dengan cara plating pada media agar di cawan petri.
Percobaan dilakukan secara duplo.
4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat Carson et al., 2002
Suspensi bakteri uji yang telah diinkubasi selama 18 jam dalam media Muller Hinton Broth. Sentrifus dingin, kecepatan 3500 rpm selama
15 menit. Selanjutnya filtrat dibuang dan pellet dalam tabung dicuci dengan dapar fospat Ph 7,4 sebanyak 2 kali. Lalu suspensikan kedalam
dapar fospat Ph 7,4 hingga volume 10 ml. Ditambahkan fraksi minyak atsiri daun sirih dengan perlakuan 1 MIC dan 2 MIC sesuai kebutuhan.
Diinkubasi kembali selama 24 jam dalam shaker 150 rpm 37 ºC. Kemudian suspensi disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3500
rpm, lalu saring dan ambil cairan supernatan. Selanjutnya ukur absobansi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm.
4.6.5. Analisis Ion Logam Ca
2+
dan K
+
Cox et al., 2000
Untuk analisis ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca
2+
dan K
+
yang keluar dari membran sel bakteri akibat perlakuan dengan minyak atsiri.
Analisis kebocoran ion dilakukan pada pelet bakteri yang dipersiapkan seperti pada pengukuran kebocoran protein dan asam nukleat. Kebocoran
dinyatakan dengan terukurnya ion-ion logam yang terdapat pada bakteri uji setelah dikontakkan dengan minyak atsiri pada perlakuan 1 MIC dan
2 MIC. Kebocoran ion Ca
2+
dan K
+
dideteksi dengan menggunkan AAS Atomic Absorption Spectrophotometre Perkin Elmer a Analist 700.
Larutan sel hasil kontak dengan minyak atsiri diambil untuk diukur kandungan ion-ionnya.
4.6.6. Analisis Perubahan Morfologi Sel dengan SEM Fathillah et al.,
2009
Suspensi bakteri umur 24 jam diberi perlakuan 1 MIC, 2 MIC fraksi minyak atsiri dan kontrol. Diinkubasi selama 24 jam pada shaker
150 rpm suhu 37 ºC. Selanjutnya suspensi bakteri tersebut disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, cairan dibuang untuk
mendapatkan masa sel bakteri pelet. Kemudian pelet dicuci dengan dapar fospat sebanyak 2 kali. Pelet difiksasi dengan glutaraldehid 2,5
selama 4 jam, Selanjutnya disentrifus dan supernatan dibuang. Pelet direndam kembali dengan larutan tannin acid 2 selama 18 jam
selanjutnya disentrifus. Supernatan dibuang dan pelet direndam dengan cacodylate buffer sebanyak 2 kali masing-masing selama 10 menit.
Kemudian disentrifus kembali, dibuang supernatan dan pelet direndam dalam osmium tetraoksida 1 dalam cacodylate buffer dibiarkan dalam
refrigerator selama 1 jam. Setelah direndam, disentrifus kembali dan pelet dicuci dengan alkohol 50 dingin, dibiarkan 10 menit dan
disentrifus kembali selama 5 menit. Kemudian supernatan dibuang dan pelet dikeringkan berturut-turut dengan alkohol 50, 70, 80 dan
alkohol 95 masing-masing selama 10 menit. Dicuci dengan alkohol absolut dan disentrifus 5 menit sebanyak 2 kali dan dicuci kembali
dengan terbutanol 2 kali. Kemudian Oleskan apusan sel diatas potongan bujur sangkar cover slip slip glas dan dikeringkan dengan terbutanol.
Slip glas yang telah diolesi dengan sel tersebut diletakkan pada stub alumunium untuk dicoating dengan emas dalam ion coater selama 1 jam
pada kondisi vakum. Kemudian diamati dengan alat Scanning Electron Microscope tipe JEOL seri JSM-5310 LV.
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil 5.1.1. Isolasi dan Penentuan Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri
Daun Sirih
Gambar 1: Daun sirih Metode yang digunakan untuk proses pemisahan komponen
kimia fraksi minyak atsiri daun sirih segar yang berasal dari Balitro, Cimanggu Bogor, adalah distilasi uap dan air Sugiastuti, 2002;
Sulianti dan Chairul, 2002. Proses distilasi ini dilakukan dengan menggunakan variasi waktu pengambilan minyak atsiri yaitu pada jam
ke-1, jam ke-2, jam ke-4 dan jam ke-6. Perbedaan waktu pengambilan distilat ini memberikan hasil yang berbeda pada kandungan komponen
kimia fraksi minyak atsirinya tabel 1. Begitu pula terhadap nilai presentase kadar yang dihasilkan masing
– masing fraksi 1,2,3 dan 4 yaitu 0.061, 0.034, 0.027 dan 0.015. Namun demikian, minyak
yang diperoleh masih memiliki aroma dan warna yang sama, dengan aroma daun sirih yang khas dan berwarna kuning jernih.
