gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
c. Mueller Hinton Agar Sebanyak 38 gr serbuk Mueller Hinton Agar dilarutkan
dalam 1 liter aquadest, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
d. Mueller Hinton Broth Sebanyak 21 gr serbuk Mueller Hinton Broth dilarutkan dalam
1 liter aquadest, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
4.6.3.3. Pembiakan Bakteri Uji
Bakteri B. Subtilis dan S. epidermidis diinokulasikan ke media Nutrien Agar miring sedangkan S. mutan diinokulasikan
ke media Blood Agar Base miring menggunakan ose yang telah disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen,
kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam.
4.6.3.4. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Stok bakteri uji yang telah diremajakan pada agar nutrien miring, Diambil dengan jarum ose 1 ose dan dimasukkan
kedalam tabung yang berisi 5 ml Mueller Hinton Broth, media untuk S. mutan ditambahkan darah steril. Kemudian divortek.
Dan diinkubasi selama 18 jam. Selanjutnya dituang ke dalam nutrien agar dan media untuk S. mutan ditambahkan darah steril.
Diencerkan hingga diperoleh suspensi 10
5
sel bakteriml. Suspensi ini yang akan digunakan dalam pengujian.
4.6.3.5. Pembuatan Larutan Uji
Larutan induk dibuat emulsi dengan menggunakan cara mencampur fraksi minyak atsiri daun sirih dengan pelarut 0.5
tween 80, etanol absolut 2 dan aquadest. Kemudian diencerkan hingga 17,5; 15; 12,5; 10; 7,5; 5; 2,5;
1; 0.5; 0,25; 0,125.
4.6.3.6. Penentuan MIC Rodriguez et.al., 2002
Metode penentuan minimum inhibitor concentration adalah adalah sebagai berikut :
Menyiapkan larutan uji yang sudah dibuat dan juga larutan kontrol.
Menyiapkan media Mueller Hinton Broth, menyiapkan microplate, selanjutnya tiap-tiap sumuran diisi dengan 100
µl media MHB, 100 µl suspensi bakteri 1x10
5
selml, dan 50 µl larutan uji dengan berbagai konsentrasi, dan juga
larutan kontrol, dan dibuat homogen.
Kemudian diinkubasikan dalam shaker 150 rpm pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Pembacaan hasil percobaan didasarkan pada keruh atau tidaknya sumuran percobaan dibandingkan kontrol untuk
menentukan MIC dan juga dengan cara plating pada media agar di cawan petri.
Percobaan dilakukan secara duplo.
4.6.4. Analisis Protein dan Asam Nukleat Carson et al., 2002
