Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Jenis Penelitian

commit to user 3 akan mengamati efek hepatoprotektif buah kiwi dari aspek gambaran histologis sel hepar.

B. Perumusan Masalah

Apakah pemberian sari buah kiwi dapat mengurangi kerusakan histologis sel hepar mencit akibat pemberian parasetamol?

C. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum Untuk mengetahui efek hepatoprotektif sari buah kiwi dalam melindungi hepar dari paparan parasetamol. 2. Tujuan khusus Untuk mengetahui pengaruh pemberian sari buah kiwi Actinidia deliciosa dalam mengurangi kerusakan histologis sel hepar mencit akibat pemberian parasetamol.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai pengaruh sari buah kiwi dalam mengurangi kerusakan histologis sel hepar mencit akibat pemberian parasetamol. commit to user 4 2. Manfaat Aplikatif a. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan pertimbangan dalam mengembangkan buah kiwi Actinidia deliciosa menjadi obat fitofarmaka yang berkhasiat antioksidan b. Penelitian ini diharapkan dapat lebih mengenalkan manfaat buah kiwi sebagai antioksidan pada masyarakat luas. commit to user 5 BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Kiwi Actinida deliciosa

a. Taksonomi Kingdom : Plantae Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Ordo : Ericales Family : Actinidiaceae Genus : Actinidia Species : Actinidia deliciosa Liang dan Ferguson, 2010 b. Asal usul kiwi Buah kiwi sebenarnya asli dari Cina. Tanaman kiwi tumbuh liar di lembah sungai Yang-Tze, Cina, sejak tahun 1600-an. Di negara asalnya, buah bernama latin Actinidia Deliciosa ini dikenal dengan nama yang tao. Nama ’yang tao’ diberikan oleh seorang kaisar dari Dinasti Khan yang menganggap buah berdaging hijau itu memiliki cita rasa tinggi Astawan dan Leomitro, 2008. commit to user 6 Sejak tahun 1904 benih kiwi dibawa dari Cina ke Selandia Baru untuk mulai ditanam di dataran Selandia Baru. Orang Selandia Baru menganggap buah yang disebut yang tao di China itu memiliki cita rasa gooseberry, meskipun tidak berhubungan keluarga Grossulariaceae gooseberry. Baru sekitar tahun 1959 buah tersebut diberi nama ’buah kiwi’ setelah penetapan burung kiwi sebagai simbol Selandia Baru. Buah kiwi ini sangat populer dengan prajurit Amerika yang ditempatkan di Selandia Baru selama Perang Dunia II, sejak saat itu buah kiwi menjadi populer di seluruh dunia Ide, 2010. Kultivar kiwi umumnya berbentuk oval, dengan ukuran telur ayam panjang 5-8 cm dan diameter 4,5-5,5 cm. Kulit berwarna hijau gelap kecoklatan dengan daging buah warna hijau terang atau kuning emas dengan barisan biji berwarna hitam kecil yang bisa dimakan. Buah ini teksturnya lembut dan beraroma unik. Kiwi hijau lebih berbulu kulitnya, dengan rasa lebih segar dan lebih tajam. Kiwi kuning kulitnya lebih mulus dan cita rasa manis buah tropis Ide, 2010 Di Selandia Baru buah kiwi biasa tumbuh secara alami di ketinggian antara 2.000 dan 6.500 kaki 600-2.000 m dengan curah hujan yang berat dan berlimpahnya salju dan es di musim dingin. Dalam musim dingin, buah kiwi dapat hidup di suhu harian minimum dari 4,44°C - 5,56°C dan suhu maksimumnya 13,89°C- 15,56°C; di musim panas, suhu rata-rata minimum adalah 13,33- commit to user 7 13,89 dan maksimumnya di suhu 23,89°C– 25°C. Dengan curah hujan tahunan adalah 51-64 kali dan kelembapan relatif 76-78 Morton, 1987. c. Kandungan buah kiwi Buah kiwi memiliki banyak kandungan nutrisi, bahkan jumlahnya tersimpan lebih banyak dibanding buah-buahan lain. Di antaranya vitamin E sebagai antioksidan dan untuk kesehatan jantung serta, vitamin C sebagai antioksidan dan mengurangi tingkat plasma lipid dan respons agregasi trombosit Asim dan Aud, 2004. Selain vitamin C dan E, jenis antioksidan lain yang terkandung dalam buah kiwi adalah senyawa-senyawa fitokimia tertentu, seperti: karoten, lutein, xanthophyll, flavonoid dan klorofil Astawan dan Leomitro, 2008. Kapasitas antioksidan terhadap senyawa radikal bebas buah kiwi bahkan menempati posisi ketiga setelah jeruk dan anggur merah. Perbandingan nutrisi kiwi dan buah yang lain per 100 gram adalah sebagai berikut: commit to user 8 Tabel 1 . Perbandingan Kekuatan Buah Kiwi Dibanding Buah-Buah Lain per 100 gram. Kiwi hijau Kiwi emas Apel Pisang Pir Anggur Jeruk Energi Kj 306 226,6 199 403 169 257 158 Protein g 1 1,3 0,4 1,2 0,3 0,4 1,1 Karbohidrat g 15 11,3 11,8 23,2 10 15,4 8,5 Glukosa g 3,5 5,2 1,7 4,8 2,3 7,6 2,2 Vitamin C mg 100 108,9 6 11 6 3 54 Vitamin E mg 1,1 2,2 0,6 0,27 0,5 - 0,24 Folat µg 30 11 1 14 2 2 31 Kalium mg 331 230 120 400 150 210 150 Kalsium mg 26 21,4 4 6 11 13 47 Besi mg 0,4 0,4 0,1 0,3 0,2 0,3 0,1 Zinc mg 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,2 Serat g 3,4 1,4 1,8 1,1 2,2 0,7 1,7 Indeks glikemik µgg 39 48 28- 44 46-70 33- 42 43-59 31- 51 Sumber : Ide 2010 Berdasarkan tabel tersebut dapat dikatakan bahwa buah kiwi lebih kaya nutrisi dibanding buah-buahan lainnya. Itu berarti bahwa vitamin dan mineralnya lebih banyak per gramnya maupun per kalorinya Ide ,2010. Kapasitas antioksidan buah kiwi terhadap commit to user 9 senyawa-senyawa radikal bebas menempati posisi ketiga tertinggi setelah jeruk orange dan anggur merah Astawan dan Leomitro, 2008. Vitamin C dan vitamin E telah diketahui peranannya sebagai antioksidan alami yang berperan penting untuk menangkal serangan radikal bebas penyebab penuaan sel dan pemicu timbulnya berbagai penyakit. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga bebas berikatan dengan berbagai sel dan jaringan serta menjadi pemicu berbagai penyakit kanker, sakit jantung, dan terjadinya proses penuaan dini Astawan dan Leomitro, 2008. Vitamin C adalah vitamin larut air yang mempunyai banyak fungsi di dalam tubuh, sebagai koenzim atau kofaktor. Angka kecukupan vitamin C sehari adalah 75 mg untuk wanita usia 16 tahun ke atas dan 90 mg untuk pria 16 tahun ke atas Almatsier, 2009. Kandungan vitamin C buah kiwi 17 kali lebih banyak dibanding buah apel, dua kali lebih banyak dibanding jeruk dan lemon. Kandungan vitamin C inilah yang menyebabkan kiwi memiliki antioksidan yang kuat. Vitamin C membantu tubuh memproduksi pendetoks glutathione. Kadar glutathione dapat meningkat sampai 50 bila buah kiri dikonsumsi dalam 2 minggu Ide, 2010. commit to user 10 Kandungan vitamin E dalam buah kiwi dua kali lipat lebih banyak dari buah alpukat. Dalam 100 gram buah kiwi terkandung 1,1 mg vitamin E atau tokoferol yang larut dalam lemak dan sebagian besar pelarut organik, tetapi tidak larut dalam air. Karakteristik utamanya adalah bertindak sebagai antioksidan Almatsier, 2009. Vitamin E terbukti punya efek yang mirip dengan vitamin C, tetapi larut lemak dan fungsinya saling melengkapi dengan vitamin C Ide, 2010. Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa polifenol. Komponen polifenol memberikan manfaat antioksidan pada buah-buahan dan sayuran tertentu termasuk buah kiwi. Senyawa flavonoid dapat mencegah penyakit kardiovaskuler dengan cara menurunkan laju oksidasi lemak Astawan dan Leomitro, 2008. flavonoid diketahui dapat menghambat oksidasi lipid dan pembentukan lipid peroxide melalui mekanisme penangkapan radikal bebas Hegazi dan El-Hady, 2007. Karoten mempunyai dua bentuk utama, yaitu alfa-karoten dan beta-karoten. Beta-karoten mempunyai kemampuan sebagai antioksidan yang dapat berperan penting menstabilkan radikal berinti karbon. Beta-karoten juga dapat bersinergi dengan komponen zat gizi lain. Beta-karoten yang dikonsumsi berbarengan dengan vitamin C dan E mampu meningkatkan kemampuan antioksidan. Sifat antioksidan beta-karoten adalah efektif pada konsentrasi rendah commit to user 11 oksigen, sehingga dapat melengkapi sifat antioksidan vitamin E yang efektif pada konsentrasi tinggi oksigen. Beta-karoten yang bereaksi dengan radikal bebas akan menyebabkan radikal bebas menjadi stabil. Kehadiran vitamin C akan membantu menstabilkan radikal bebas beta-karoten Astawan dan Leomitro, 2008. Warna hijau pada buah kiwi disebabkan oleh kadar pigmen klorofil yang tetap tidak berubah pada proses pematangan buah kiwi. Klorofil mempunyai aktivitas biologis yaitu sebagai antioksidan dan antikanker. Selain itu, klorofil juga kaya akan zat anti peradangan, antibakteri, antiparasit Astawan dan Leomitro, 2008. Xanthophyll adalah pigmen pemberi warna kuning. Xanthophylls mempunyai kemampuan antioksidan pemecah rantai peroksidase dari membrane fosfolipid. Lutein termasuk komponen utama Xanthophyll yang banyak terdapat pada sayuran dan buah- buahan. Lutein juga lebih mudah larut dalam air dibandingkan beta- karoten. Kemudahan larut dalam air tersebut disebabkan oleh kandungan hidroksil yang lebih banyak pada lutein sehingga bersifat lebih polar dibandingkan beta-karoten. Lutein dapat berfungsi sebagai antioksidan karena kemampuannya mencegah kerusakan DNA Astawan dan Leomitro, 2008. Sementara itu, kandungan mineral yang ada dalam buah kiwi antara lain kalium pottasium, magnesium, kalsium, tembaga, seng, mangan, dan fosfor. Kandungan kalium 5,4 mgkalori lebih tinggi commit to user 12 dibanding pisang. Senyawa kalium berperan penting dalam menjaga fungsi otot dan gerak refleks sistem saraf. Kalium juga menjaga keseimbangan air dalam tubuh. Selain itu, senyawa magnesium dalam buah kiwi termasuk yang tertinggi dari 27 jenis buah yang umum dikonsumsi. Rendahnya konsumsi magnesium dapat menyebabkan hipertensi dan penyakit jantung Ide, 2010.

2. Struktur Mikroskopis Hepar

Hepar merupakan kelenjar yang terbesar dalam tubuh. Hepar dilapisi oleh kapsul tipis yang bernama Kapsul Glisson dan memiliki jaringan pengikat retikuler serta pembuluh darah di antara parenkimnya. Tipe sel yang mendominasi adalah hepatosit. Sel-sel tersebut tersusun dalam satu atau dua lapisan tebal yang dipisahkan oleh sinusoid hepar. Suplai darah hepar berasal dari vena porta dan arteri hepatik. Hepar juga memiliki tiga sistem drainase yaitu vena hepatik, pembuluh limfa, dan saluran empedu Paulsen, 2000. a. Lobulus Hepar Lobulus merupakan unit mikroskopis dan fungsional organ. Setiap lobulus merupakan badan heksagonal yang terdiri atas lempeng – lempeng sel hepar yang berbentuk kubus, tersusun radial mengelilingi vena sentralisPrice and Wilson, 1997. commit to user 13 Pembagian lobulus hepar sebagai unit fungsional dibagi menjadi 3 zona Leeson et al., 1989: Zona 1 : Zona aktif, sel – selnya paling dekat dengan pembuluh darah yaitu vena porta dan arteri hepatika, akibatnya zona ini yang pertama kali dipengaruhi oleh perubahan darah yang masuk. Zona 2 : Zona intermedia, sel – selnya memberi respons kedua terhadap darah. Zona 3 : Zona pasif, aktivitas sel-selnya rendah dan tampak aktif bila kebutuhannya meningkat. b. Parenkim Hepar Sel-sel hepar berbentuk polihedral dengan ukuran yang berbeda-beda, nukleusnya lebar, bulat, berada di tengah, mengandung satu atau lebih nukleoli serta terdapat bercak-bercak kromatin. Sitoplasma sel hepar bervariasi dalam penampakan, tergantung dari nutrisi dan status fungsionalnya. Mengandung sejumlah besar ribonukleoprotein, mitokondria, droplet lipid, lisosom, dan peroksisom Bergman et al., 1996. c. Sinusoid Hepar Bagian yang membentuk jaringan intralobuler yang kaya akan susunan pembuluh-pembuluh darah yang saling bertemu satu sama lainnya pada vena sentralis. Menurut tipe kapilernya dibedakan menjadi dua: 1 sinusoid yang lebar dan bervariasi commit to user 14 dalam ukuran diameter, dan 2 sinusoid yang dindingnya terdiri atas dua tipe sel yang dapat dibedakan, yaitu sel endotel dan sel Kupffer Jones, 1993. Sinusoid mengandung sel-sel darah, dan pada neonatus mengandung elemen hemopoetik. Di antara sinusoid terdapat sebuah celah, disebut celah disse, memisahkan permukaan hepatosit yang menghadap sinusoid dengan barisan sel endotel Damjanov, 1996 d. Mikroskopis Kerusakan Hepar Setelah Pemberian Parasetamol Hepatitis akut, dengan maupun tanpa kolestasis, merupakan gambaran histologis yang paling umum dari drug-induced liver injury DILI dan obat-obatan seperti parasetamol merupakan penyebab penting dari hepatitis akut Ramachandran and Kakar, 2009. Drug-induced liver injury disebabkan oleh dua mekanisme utama, yaitu hepatotoksisitas intrinsik dan idiosinkratik. Hepatotoksin intrinsik menyebabkan kerusakan hepatoselular pada mekanisme yang tergantung pada dosis baik secara langsung oleh obat tersebut maupun melalui metabolitnya. Parasetamol termasuk dalam mekanisme hepatotoksisitas intrinsik ini. Hepatotoksisitas intrinsik bermanifestasi dengan nekrosis hepatoselular dengan sedikit inflamasi, sementara pada hepatotoksisitas idiosinkratik lebih sering terjadi inflamasi Ramachandran and Kakar, 2009. commit to user 15 Nekrosis zona sentral zona 3 merupakan karakteristik kerusakan karena asetaminofen dan halotan, serta toksin seperti karbon tetraklorid Ramachandran and Kakar, 2009.

3. Parasetamol

a. Farmakodinamik Efek analgesik parasetamol serupa dengan salisilat yaitu menghilangkan atau mengurangi nyeri ringan sampai sedang Parasetamol menurunkan suhu tubuh dengan mekanisme yang diduga juga berdasarkan efek sentral sepert salisilat Wilmana dan Gunawan, 2007. Efek antiinflamasinya sangat lemah, oleh karena itu parasetamol tidak digunakan sebagai antireumatik. Parasetamol merupakan penghambat biosintesis prostaglandin yang lemah. Efek iritasi, erosi dan perdarahan lambung tidak terlihat, demikian juga gangguan pernafasan dan keseimbangan asam basa Wilmana dan Gunawan, 2007. b. Farmakokinetik Parasetamol diabsorpsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi dalam plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh cairan tubuh. Dalam plasma, 25 parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol dimetabolisme oleh enzim mikrosom hepar. commit to user 16 Sebagian besar parasetamol 80 dikonjugasi dengan asam glukoronat dan sebagian kecil lainnya dengan asam sulfat Wilmana dan Gunawan, 2007. Hasil konjugasi ini akan dieliminasi lewat urin Parod dan Dolgin, 1992. Selain itu dalam jumlah kecil 4 diubah menjadi metabolit reaktif berupa senyawa antara yang reaktif dan toksik yaitu N-asetil-p-benzoquinonimin NAPQI Brunton et al., 2006. NAPQI dibentuk dengan adanya bioaktivasi parasetamol melalui sistem sitokrom P-450 Klaassen dan Watkins, 2003. Metabolit tersebut kemudian didetoksifikasi oleh glutation hepar menjadi metabolit sistin dan metabolit merkapturat yang non toksik. Pada dosis tinggi, jalur konjugasi parasetamol menjadi jenuh sehingga banyak parasetamol menjadi metabolit NAPQI, sebagai akibatnya terjadi deplesi glutation hepar, bahkan kandungan glutation hepar dapat dihabiskan paling tidak berkurang 20-30 harga normal Rochmah, 2000. Akibatnya NAPQI akan membentuk ikatan kovalen dengan protein sel hepar secara irreversibel sehingga akan menyebabkan pengikatan kovalen pada makromolekul seperti DNA, RNA, dan protein. Jika demikian, maka akibat yang parah pada fungsi sel akan segera terlihat dengan nyata Murray et al., 2003. c. Indikasi Khasiatnya sebagai analgetik dan antipiretik, tetapi tidak sebagai antiradang. Dewasa ini pada umumnya dianggap sebagai commit to user 17 antinyeri yang paling aman, juga untuk swamedikasi pengobatan mandiri. Efek analgetiknya diperkuat oleh kodein dan kafein Tjay dan Raharja, 2002. Parasetamol tidak mempengaruhi kadar asam urat dan sifat penghambatan plateletnya lemah. Obat ini berguna untuk nyeri ringan sampai sedang seperti sakit kepala, mialgia, nyeri persalinan, dan keadaan lain dimana aspirin efektif sebagai analgesik. Parasetamol tidak efektif untuk mengatasi inflamasi seperti artritis rematoid, sekalipun parasetamol dapat dipakai sebagai obat tambahan analgesik dalam terapi antiinflamasi. Parasetamol lebih disukai daripada aspirin pada pasien dengan hemofilia atau dengan riwayat ulkus peptikum dan juga pada pasien yang mengalami bronkospasme yang dipicu akibat aspirin Katzung, 2002. d. Efek samping Efek samping yang sering terjadi antara lain reaksi hipersensitivitas dan kelainan darah Tjay dan Raharja, 2002. Efek merugikan paling serius akibat overdosis asetaminofen akut berupa nekrosis hati yang fatal. Nekrosis tubulus ginjal dan koma hipoglikemik mungkin juga terjadi Hardman et al., 2008. Hepatotoksisitas dapat terjadi pada pemberian dosis tunggal 10-15 gram 200-250 mg kgBB parasetamol Wilmana dan Gunawan, 2007. Selain itu overdosis dapat menimbulkan antara lain mual, muntah, dan anoreksia. Penanggulangannya dengan cuci lambung, di commit to user 18 samping perlu pemberian zat penawar asam amino N-asetilsistein atau metionin sedini mungkin, sebaiknya dalam 8-10 jam setelah intoksikasi. Wanita hamil dapat menggunakan parasetamol dengan aman, juga selama laktasi walaupun mencapai air susu ibu Tjay dan Raharja, 2002.

4. Mekanisme Kerusakan Hepar Oleh Parasetamol Dan Mekanisme

Hepatoprotektor Sari Buah Kiwi. Pada kondisi normal, parasetamol yang diabsorbsi oleh tubuh dikonjugasi dengan asam glukuronat dan asam sulfat, dan sebagian kecil diubah menjadi metabolit N-asetil-p-benzoquinonimin NAPQI. Metabolit NAPQI ini oleh glutation hepar diubah menjadi sistin dan merkapturat yang kemudian dibuang melalui urin Wilmana dan Gunawan, 2007. Jika jumlah parasetamol yang dikonsumsi jauh melebihi dosis terapi, maka asam glukoronat dan asam sulfat dalam hepar akan habis cadangannya, kemudian terbentuklah metabolit reaktif NAPQI yang berlebihan. Selama glutation tersedia untuk mendetoksifikasi NAPQI tersebut, maka tidak akan terjadi reaksi hepatotoksisitas. Namun, bila glutation terus terpakai, akhirnya terjadi pengosongan glutation dan terjadi penimbunan metabolit NAPQI yang toksik dan reaktif. N-asetil- p-benzoquinonimin NAPQI merupakan metabolit minor dari parasetamol yang sangat aktif dan bersifat toksik bagi hepar dan ginjal. commit to user 19 Metabolit ini akan bereaksi dengan gugusan nukleofilik yang terdapat pada makromolekul sel hepar, seperti protein, menimbulkan hepatotoksisitas yang menyebabkan nekrosis hepar Wilmana dan Gunawan, 2007;Katzung 1998. Selain itu, NAPQI dapat menimbulkan stres oksidatif, yang berarti bahwa NAPQI dapat menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid merupakan bagian dari proses atau rantai terbentuknya radikal bebas Rubin et al.,2005. Radikal bebas mampu mengubah suatu molekul menjadi radikal bebas baru dan akan membentuk radikal bebas kembali sehingga terjadilah reaksi rantai chain reaction Widjaja, 1997. Kerusakan hepar akibat parasetamol dapat terjadi karena reaksi toksik, alergi dan radikal bebas. Biasanya kerusakan yang terjadi merupakan nekrosis di sekitar vena sentralisnekrosis sentrolobularis karena sitokrom P-450 paling banyak terdapat pada zona tersebut Wenas, 1996. Kadar vitamin C dalam buah kiwi membantu tubuh memproduksi glutation. Kadar glutation dapat meningkat 50 dalam 2 minggu Ide, 2010. Karena glutation meningkat, maka metabolit NAPQI yang bersifat toksik akan berikatan dengan glutation, menghasilkan asam merkapturat yang non toksik Greiner, 1990. Penelitian membuktikan bahwa dalam buah kiwi terkandung vitamin C dan vitamin E yang besar bersifat antioksidan yang kuat. Kemampuan antioksidan vitamin C dan vitamin E dan kecenderungan commit to user 20 untuk nitrasi membuatnya merupakan perangkap yang kuat untuk oksidan reaktif dan spesies nitrogen sehingga mampu menangkal radikal bebas hasil dari pembentukan NAPQI pada toksisitas parasetamol Ide, 2008. Selain vitamin C dan E, jenis antioksidan lain yang terkandung dalam buah kiwi adalah senyawa-senyawa fitokimia tertentu, seperti: karoten, lutein, xanthophyll, flavonoid dan klorofil Astawan dan Leomitro, 2008. commit to user 21

5. Kerangka Pemikiran

Keterangan: : memacu : menghambat Nekrosis sel hepar Variabel luar yang tidak terkendali: kondisi psikologis, keadaan awal hepar dan reaksi hipersensitifitas Sari buah kiwi antioksidan Parasetamol dosis toksis Bioaktivasi sitokrom P450 Meningkatkan NAPQI elektrofilik Deplesi glutation Ikatan kovalen NAPQI dgn makromolekul nukelofilik Radikal bebas Stres Oksidatif Lipid peroxidase Kerusakan makromolekul Vitamin C Vitamin E Flavonoid Klorofil Karoten Lutein xantophyll commit to user 22

6. Hipotesis

Pemberian sari buah kiwi dapat mengurangi kerusakan histologis sel hepar mencit akibat pemberian parasetamol. commit to user 23 BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Peneliti mengadakan perlakuan terhadap sampel yang telah ditentukan yaitu berupa hewan coba di laboratorium. B. Lokasi Penelitian Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Subyek Penelitian Populasi : Mencit Mus musculus jantan dengan galur Swiss webster berusia 2-3 bulan dengan berat badan ± 20 gram. Sampel : Menurut Purawisastra 2001, jumlah sampel yang digunakan berdasarkan rumus Federer yaitu : k-1n-1 15 3-1n-1 15 2 n-1 15 2n 15+2 n 9 Keterangan : k : Jumlah kelompok commit to user 24 n : Jumlah sampel dalam tiap kelompok Pada penelitian ini jumlah sampel untuk tiap kelompok ditentukan sebanyak 10 ekor mencit n 9, dan jumlah kelompok mencit ada 3 sehingga penelitian ini membutuhkan 30 mencit dari populasi yang ada. Sampel didapatkan dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu LPPT Universitas Gajah Mada UGM, Yogyakarta.

D. Teknik Sampling