Jenis dan Rancangan Penelitian Sampel dan Besar Sampel Penelitian .1 Sampel Penelitian Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis Penelitian: Eksperimental laboratoris Rancangan Penelitian: Posttest only control group design. 3.2 Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.2.1 Sampel Penelitian Sampel pada penelitian ini menggunakan resin akrilik polimerisasi panas yang dibuat dalam bentuk lempengan dengan ukuran 10x10x1 mm ANSIADA No.12 Tahun 2008 Gambar 7. 54 10 mm 10 mm 1 mm Gambar 7. Ukuran sampel

3.2.2 Besar Sampel Penelitian

Pada penelitian ini jumlah sampel minimal diestimasi berdasarkan rumus sebagai berikut: t-1 r-1 ≥15 Universitas Sumatera Utara Keterangan: t: Jumlah perlakuan r: Jumlah sampel Dalam penelitian ini, terdapat 5 kelompok perlakuan yaitu resin akrilik polimerisasi panas yang direndam dalam ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 25,35,45, klorheksidin dan kontrol. Maka t=5 dan jumlah sampel r setiap kelompok dapat ditentukan sebagai berikut: t-1 r-1 ≥ 15 5-1 r-1 ≥ 15 4 r-1 ≥ 15 4r-4 ≥ 15 4r ≥ 15+4 4r ≥ 19 r ≥ 5 n = 6 Jumlah sampel untuk masing masing kelompok adalah 6 buah. Maka total sampel yang digunakan dalam penelitian adalah sebanyak 30 buah untuk 5 kelompok, yang terdiri dari 6 sampel untuk perendaman basis gigi tiruan resin akrilik polimerisasi panas dalam ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35,6 sampel untuk perendaman basis gigi tiruan resin akrilik polimerisasi panas dalam ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35,6 sampel untuk perendaman basis gigi tiruanresin akrilik polimerisasi panas dalam ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 55, 6 sampel untuk perendaman basis gigi tiruan resin akrilik polimerisasi panas dalam larutan klorheksidin 0,2 dan 6 sampel untuk perendaman basis gigi tiruan dalam akuades kontrol. 3.3 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.3.1 Klasifikasi Variabel

3.3.1.1 Variabel Bebas

Resin akrilik polimerisasi panas yang direndam dalam ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35, 45, 55 dan larutan klorheksidin glukonat 0,2. Universitas Sumatera Utara

3.3.1.2 Variabel Terikat

Jumlah Candida albicans CFUml

3.3.1.3 Variabel Terkendali

1. Ukuran sampel 2. Model Induk 3. Resin akrilik polimerisasi panas 4. Perbandingan powder dan liquid resin akrilik polimerisasi panas 5. Perbandingan powder gips keras dan air 6. Waktu pengadukan gips 7. Suhu dan waktu kuring 8. Tekanan pres hidrolik 9. Lama perendamanlempeng uji 10. Jumlah ekstrak daun sirsak 35, 45, 55, klorheksidin dan akuades 11. Suhu dan waktu inkubator 12. Suhu dan waktuautoclave 13. Media pertumbuhan Candida albicans 14. Media cair pertumbuhan Candida albicans 15. Phosphate Buffer Saline PBS 16. NaCl 0,9 17. Saliva buatan 18. Bahan pelarut ekstrak kental daun sirsak 19. Peneliti yang sama Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Definisi Operasional

Tabel 1. Definisi Operasional Variabel Bebas No Variabel Bebas Definisi Operasional Skala Ukur Alat Ukur 1. Ekstrak Daun Sirsak dengan konsentrasi 35, 45, 55 Hasil ekstraksi daun sirsak yang dilarutkan dalam dimethyl sulfoksida DMSO.Untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak daun sirsak 35 maka digunakan 3,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dalam DMSO sampai 10 ml, untuk konsentrasi 45 maka digunakan 4,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dalam DMSO sampai 10 ml, dan untuk konsentrasi 55 maka digunakan 5,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dalam DMSO sampai 10 ml. - - 2. Klorheksidin Glukonat 0,2 Pembersih gigi tiruan dengan kandungan klorheksidin glukonat 0,2 dengan nama dagang Minosep. - - Tabel 2. Definisi operasional variabel terikat No. Variabel Terikat Definisi Operasional Skala Ukur Alat Ukur 1. Jumlah Candida albicans Jumlah Candida albicans dalam satuan CFUml. Skala Ratio secara langsung dengancolony counter. Tabel 3. Definisi Operasional Variabel Terkendali No. Variabel Terkendali Definisi Operasional Skala Ukur Alat Ukur 1. Ukuran sampel Sampel terbuat dari resin akrilik polimerisasi panas, diperoleh dari model induk yang terbuat dari kuningan dengan ukuran 10x10x1mm ANSIADA No. 12 Tahun 2008. - - 2. Model Induk Terbuat dari kuningan dengan ukuran 10x10x1mm. - - 3. Resin akrilik polimerisasi panas Resin jenis polimetil metakrilat dengan merek QC-20 yang polimerisasinya dengan pemanasan. - - 4. Perbandingan powder dan liquid resin akrilik polimerisasi panas Perbandingan antara jumlah polimer: monomer yang digunakan pada satu sampel resin akrilik polimerisasi panas adalah 1,3gr : 1ml. - - 5. Perbandingan powder gips keras dan air perbandingan adonan gips polimer : monomer yang digunakan, yaitu: Kuvet atas = 200 gr gips : 120 ml air Kuvet bawah = 250 gr gips : 150 ml air. - - No. Variabel Terkendali Definisi Operasional Skala Ukur Alat Ukur Universitas Sumatera Utara 6. Waktu pengadukan gips Waktu yang digunakan untuk mengaduk gips dengan spatula 15 detik kemudian dilanjutkan dengan vacuum mixer selama 30 detik. - - 7. Suhu dan waktu kuring Suhu dan waktu yang diperlukan untuk polimerisasi yaitu pada suhu 70ºC dibiarkan selama 90 menit, kemudian dinaikkan menjadi 100ºC selama 30 menit menggunakan water bath. - - 8. Tekanan pres hidrolik Tekanan yang digunakan untuk mengepres kuvet yang telah berisi resin akrilik polimerisasi panas menggunakan pres hidrolik dengan tekanan pertama mencapai 1000 psi, lalu kuvet dibuka. Akrilik yang berlebih dipotong dengan menggunakan lecron mass. Kuvet atas ditutup, dilakukan press kembali secara perlahan-lahan. Buka kuvet atas, plastik selopan dilepas dan akrilik yang berlebih dipotong menggunakan lecron mass. Kuvet atas ditutup lalu dilakukan penekanan akhir sampai 2000 psi. Baut kuvet dipasang untuk mempertahankan kuvet atas dan bawah rapat kemudian dibiarkan selama 15 menit. - - 9. Lama perendaman sampel Waktu yang digunakan untuk merendam sampel yang dianjurkan adalah 15 menit. - - 10. Jumlah ekstrak daun sirsak 35, 45, 55, klorheksidin dan akuades Jumlah volume dalam ml yang digunakan untuk merendam sampel yaitu 2 ml. - - 11. Suhu dan waktu inkubator Suhu dan waktu yang dipergunakan untuk mengkultur Candida albicans yaitu 37ºC selama 24 jam. - - 12. Suhu dan waktu autoclave Suhu dan waktu yang dipergunakan untuk mensterilkan alat menggunakan uap tekanan tinggi yang dapat membunuh semua jenis mikroorganisme termasuk spora, yaitu 121ºC selama 1 jam. - - 13. Media pertumbuhan Candida albicans Media yang digunakan adalah Sabourand’s dextrose agar SDA - - 14. Media cair pertumbuhan Candida albicans Media cair yang digunakan adalah Sabouraud Dextrose Broth SDB - - 15. Phosphate Buffer Saline PBS Cairan untuk membilas sampel uji setelah perendaman dengan saliva steril. Digunakan untuk menjaga keadaan pH yaitu 7 – 7,6. - - 16. Nacl 0.9 Larutan untuk membuat kekeruhan Candida albicans sesuai dengan standar Mac Farland. - - 17. Saliva buatan Saliva yang diperoleh dengan campuran NaCl, KCN, NaHCO 3, KCl, H 2 NCONH 2 , Na 2 HPO 4 dan air akuades serta mempunyai pH=7. menyesuaikan keadaan rongga mulut. - - No. Variabel Terkendali Definisi Operasional Skala Ukur Alat Ukur Universitas Sumatera Utara 18. Bahan pelarut ekstrak kental daun sirsak Bahan pelarut yang digunakan adalah Dimethyl sulfoksida DMSO. Merupakan pelarut bagi bahan organik dan anorganik. - - 19. Peneliti yang sama Operator yang melakukan penelitian adalah satu orang. - - 3.4 Tempat dan Waktu Penelitian 3.4.1 Tempat Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU

3.4.2 Tempat Pembuatan Sampel

Unit UJI Laboratorium Dental FKG USU

3.4.3 Tempat Pengujian Sampel

Laboratorium Penelitian Mikrobiologi FMIPA USU

3.4.4 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan bulan Mei 2016 3.5 Alat dan Bahan Penelitian 3.5.1 Alat Penelitian

3.5.1.1 Alat yang Digunakan untuk Menghasilkan Sampel

1. Kuvet logam Smic, Cina 2. Model induk terbuat dari kuningan dengan ukuran 10x10x1mm 3. Rubber bowl dan Spatula 4. Mikromotor Strong, Korea 5. Timbangan biasa Lion Star, Indonesia 6. Vacuum mixer Whip, USA 7. Vibrator Fili Manfredi, Italia 8. Hydraulic press OL 57Manfredi, Italia 9. Water bath model 1H Fili Manfredi, Italia 10. Straight handpiece Strong, Korea Universitas Sumatera Utara 11. Lecron mass Smic, Cina 12. Alat pengaduk resin akrilik dan pot dari porselen 13. Bur frasser 14. Kertas ampelas nomor 600 Atlas Brand, Inggris

3.5.1.2 Alat yang Digunakan Untuk Menghasilkan Ekstrak Daun Sirsak

1. Timbangan biasa Lion Star, Indonesia 2. Lemari Pengering 3. Kertas saring 4. Perkolator 5. Rotavapor 6. Blender 7. Timbangan neraca Okaus Dial-O-Gram, Cina

3.5.1.3 Alat yang Digunakan Untuk Menguji Sampel

1. Gelas beker 200ml Pyrex, Jepang 2. Pipet ukur 1ml dan pipet fillerPyrex, Jepang 3. Tabung reaksiIwaki Pyrex, Indonesia 4. Rak tabung 5. Cawan petri Pyrex, Jepang 6. Pinset Smic, Cina 7. Inkubator Memmert, Jerman Gambar 8 Universitas Sumatera Utara Gambar 8.InkubatorMemmert, Jerman 8. Vortex Fisons, InggrisGambar 9 Gambar 9.Vortex Fisons, Inggris 9. Autoclave Yamato, Jepang Gambar 10 Gambar 10. AutoclaveYamato, Jepang 10. Ose 2 buah 11. Labu Erlenmeyer Iwaki pyrex, Jepang 12. Colony counter Stuart Scientics, UK 13. Bunsen Universitas Sumatera Utara

3.5.2 Bahan Penelitian

1. Resin akrilik polimerisasi panas QC-20, Inggris 2. Could Mould Seal QC-20, Inggris 3. Gips keras Moldano, China 4. Vaselin untuk bahan separasi 5. Plastik Selopan 6. Klorheksidin 0,2 Minosep 7. Daun Sirsak 8. Etanol 70 9. Larutan dimethyl sulfoksida DMSO 10. Saliva buatan 11. Akuades Kimia Farma, Indonesia 12. Phosphate Buffer Saline 13. Suspensi jamur Candida albicans 14. Saboraud’s dextrose broth SDB 15. Saboraud’s dextrose agar SDA 16. Spiritus 17. Aluminium foilTotal, Indonesia 18. Kapas Bio Panca, Indonesia 19. Air 3.6 Cara Penelitian 3.6.1 Persiapan Pembuatan Sampel Lempeng uji dibuat dari resin akrilik polimerisasi panas yang diperoleh dari model induk yang terbuat dari kuningan dengan ukuran 10x10x1mm.

3.6.1.1 Pembuatan Mold

a. Membuat adonan gips keras, perbandingan gips keras dengan air untuk kuvet atas adalah 200 gram gips: 100 ml air dan untuk kuvet bawah adalah 250 gram gips: 150 ml air. Universitas Sumatera Utara b. Adonan diaduk dengan spatula selama 15 detik sampai tercampur homogen selama 30 detik c. Adonan gips keras dimasukkan ke dalam kuvet yang telah disiapkan di atas vibrator. d. Letakkan10 model induk pada adonan gips keras yang mulai mengeras dalam satu kuvet. e. Setelah agak mengeras, gips keras dirapikan dan didiamkan sampai mengeras selama 60 menit. f. Permukaan gips keras diolesi dengan vaselin kemudian kuvet atas dipasangkan dan diisi dengan adonan gips keras di atasvibrator. g. Setelah gips mengeras, kuvet dibuka, model induk diangkat, cetakan model yang didapat dituang air panas untuk membuang sisa vaselin sampai bersih. h. Setelah dingin dan kering, olesi dengan separator cold mould seal, tunggu selama 20 menit sesuai petunjuk pabrik Gambar 11. Gambar 11. Pembuatan mold pada gips keras

3.6.1.2 Pengisian Resin Akrilik Pada Mold

a. Polimer dan monomer diaduk dalam pot porselen dengan perbandingan 1,3 gr :1 ml untuk satu sampel dan adonan diaduk dengan spatula stainless steel sampai monomer dan polimer tercampur dengan baik dan homogen. Adonan didiamkan kira kira selama waktu yang dianjurkan pabrik, sampai fase dough stage tidak lengket dan tidak menempel pada dinding pot porselen. b. Mold yang telah diolesi separator diisi penuh dengan adonan resin akrilik. c. Plastik selopan diletakkan diantara kuvet atas dan bawah, lalu ditutup dan ditekan perlahan menggunakan Hydraulic pressdengan tekanan 1000psi 70 kgcm 2 Universitas Sumatera Utara d. Kuvet dibuka dan kelebihan akrilik dipotong menggunakan lecron mass, kemudian kuvet ditutup kembali, dilakukan pengepresan dengan tekanan 2000psi 154 kgcm 2 kemudian baut dipasang untuk mempertahankan kuvet atas dan bawah rapat, kemudian dibiarkan selama 15 menit Gambar 12. Gambar 12.Pengisian resin akrilik pada mold

3.6.1.3 Kuring

Kuvet dimasukkan kedalam water bath, suhu dan waktu diatur pada fase I 70ºC selama 90 menit dan fase II 100ºC selama 30 menit. Kuvet dikeluarkan dari kuring unit dan dibiarkan dingin sampai suhu kamar.

3.6.1.4 Penyelesaian Akhir

Sampel dikeluarkan dari kuvet, kemudian dirapikan untuk menghilangkan bagian yang tajam dengan menggunakan bur fraser. Sampel kemudian dihaluskan dengan kertas ampelas waterproof dengan nomor 600 dibawah air mengalir sampai memperoleh ukuran yang diinginkan.

3.6.2 Pembuatan Ekstrak Daun Sirsak

a Daun sirsak dipotong dan ditimbang sebanyak 500 gram kemudian dicuci bersih dengan air mengalir dan ditiriskan. Universitas Sumatera Utara b Daun sirsak dikeringkan dengan menggunakan lemari pengering ±35ºC selama 7 hari Gambar 13. Gambar 13. Daun sirsak c Daun sirsak yang sudah kering dihaluskan dengan blender sehingga didapat serbuk sebanyak 300 gram Gambar 14. Gambar 14.Daun sirsak dihaluskan dengan blender d Kemudian dimaserasi dengan direndam dengan etanol 70 sebanyak ±1 liter sambil diaduk sesekali lalu dibiarkan selama 1 jam dalam wadah penyimpanan yang tertutup Gambar 15. Universitas Sumatera Utara Gambar 15. Dimaserasi sambil diaduksesekali e Setelah direndam selama 1 jam, larutan tersebut diperkolasi dengan kertas saring melalui perkolator, kemudian dituangkan kembali etanol 70 sebanyak 1 liter Gambar 16. Gambar 16. Perkolator f Kemudian dengan rotavapor digunakan untuk memisahkan antara pelarut dan ekstraknya, maka diperoleh ekstrak kental daun sirsak sebanyak 30 gram Gambar 17. Universitas Sumatera Utara Gambar 17. Ekstrak kental daun sirsak g Untuk pembuatan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35 maka digunakan 3,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dengan dimethyl sulfoksidaDMSO sampai 10 ml. h Untuk pembuatan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 45 maka digunakan 4,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dengan dimethyl sulfoksidaDMSO sampai 10 ml. i Untuk pembuatan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 55 maka digunakan 5,5 gram ekstrak kental daun sirsak kemudian dilarutkan dengan dimethyl sulfoksidaDMSO sampai 10 ml.

3.6.3 Penentuan Jumlah Candida albicans

a. Sampel disterilisasi dengan autoclave 121ºC selama 1 jam b. Sampel dibagi menjadi lima kelompok yaitu kelompok ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35, 45, 55, klorheksidin dan akuadeskontrol. Tiap kelompok terdiri dari 6buah sampel. c. Sampel direndam dalam saliva buatan selama 1 jam dalam suhu 37ºC. Kemudian dibilas sebanyak 2 kali menggunakan phosphate buffered salineGambar 18. Universitas Sumatera Utara Gambar 18. Sampel direndam dalamsaliva buatan d. Sampel dikontaminasikan dengan Candida albicans dengan cara dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi suspensi Candida albicans. Pembuatan suspensi Candida albicansdilakukan dengan mengambil 1-2 ose biakan murni Candida albicans yang telah dikultur kemudian dicampurkan dengan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan yang sesuai dengan standar Mac Farland atau sebanding dengan 1x10 8 CFUml. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC Gambar 19. Gambar 19. Sampel dikontaminasikan Universitas Sumatera Utara denganCandida albicans e. Setelah 24 jam, sampel dikeluarkan dari tabung reaksi. Tiap satu sampel dimasukkan ke dalam satu tabung reaksi yang berisi masing masing yaitu ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35, 45, 55, Klorheksidin dan akuades sebanyak 2ml. Waktu perendaman dalam tabung reaksi yang berisi ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 35,45,55, klorheksidin dan akuades adalah 15menitGambar 20. Gambar 20.Lempeng uji direndam dalam ekstrak daun sirsak, klorheksidin dan akuades f. Sampel dikeluarkan dari tabung reaksi dan dibilas dengan Phosphate Buffered Saline sebanyak 2 kali. g. Sampel dimasukkan ke dalam sabouraud’s broth 10 ml, digetarkan dengan vortex selama 30 detik untuk melepaskan Candida albicans yang melekat pada sampel Gambar 21. Universitas Sumatera Utara Gambar 21. Sampel digetarkan denganvortex h. Selanjutnya dilakukan pembenihan 0,1 ml Sabouraud’s broth pada Sabouraud’s dextrose agar SDA, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC. i. Setelah 48 jam dilakukan penghitunganCandida albicansdengan menggunakan colony counter CFUml dalam 100ml Gambar 22. Gambar 22. Perhitungan dengan colony counter Universitas Sumatera Utara

3.7 Analisis Data

Analisis data yang digunakan: 1. Uji Univarian, untuk mengetahui nilai rata-rata dan standar deviasi setiap kelompok. 2. Uji t tidak berpasangan, untuk melihat pengaruh perendaman basis gigi tiruan resin akrilik polimerisasi panas terhadap jumlahCandida albicans antara kelompok ekstrak daun sirsak35,45, 55 dan klorheksidin 0,2 dengan kelompok kontrol. 3. Uji LSD Least Significant Difference, untuk melihat perbedaan pengaruh perendaman basis gigi tiruan resin akrilik polimerisasi panas terhadap jumlah Candida albicans antar kelompok perlakuan yaitu, ekstrak daun sirsak 35, 45, 55 dan klorheksidin 0,2. Universitas Sumatera Utara

3.8 Kerangka Operasional Penelitian