BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Waktu dan Tempat
Kegiatan penelitian dilakukan dari bulan Mei hingga bulan Juli 2011. Penelitian dilakukan di dua tempat, yaitu kandang milik MT. Farm di Desa
Tegalwaru, Kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor dan laboratorium Fisiologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu spuit, seperangkat alat USG, tabung reaksi, gelas objek, hemositometer, selotip, lap, marker, kertas label,
tabung kapiler, alat penghitung, kamar hitung darah Neubauer, Adam Mikrohematokrit reader, penyumbat tabung kapiler, alat sentrifugasi, tambang,
dan mikroskop cahaya. Bahan yang digunakan dalam penelitian, diantaranya 21 ekor domba
betina tidak bunting, hormon Prostaglandin PGF
2
alpha dinoprost dan tromethamin, hormon Pregnant Mare Serum Gonadotropin PMSG dan human
Chorionic Gonadotropin hCG, pengencer Turk, NaCl fisiologis 0,9, antikoagulan Ethilen Diamine Tetraasetate EDTA, selang penanda terdiri atas
empat warna.
3.3. Tahap Persiapan 3.3.1. Hewan Percobaan
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini ialah 21 ekor domba betina lokal yang telah dewasa kelamin. Domba-domba tersebut memiliki kisaran
bobot badan antara 15 hingga 25 kg.
3.3.2. Aklimatisasi Domba
Sebelum mendapat perlakuan, domba penelitian dipelihara selama dua minggu untuk diaklimatisasikan. Tujuan aklimatisasi ialah untuk memberikan
kesempatan agar domba-domba tersebut menyesuaikan diri terhadap lingkungan.
Selama aklimatisasi domba diberikan antibiotik, anthelmintik, dan vitamin B kompleks agar kondisi domba tetap sehat dan kembali prima.
3.3.3. Kandang, Pakan, dan Minum
Kandang yang digunakan dalam penelitian ialah kandang kelompok dengan konstruksi kandang panggaung dengan ketinggian 50 cm dari permukaan
tanah. Pakan domba perlakuan yang diberikan terdiri atas hijauan dan ampas tahu. Hijauan diberikan pada pagi dan sore hari, sedangkan pada siang hari diberikan
ampas tahu. Pemberian air minum dilakukan secara tidak terbatas atau ad libitum.
3.4. Tahap Pelaksanaan 3.4.1. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap dengan 4 perlakuan, yaitu
Kelompok perlakuan pertama yaitu kontrol yang tidak disuperovulasi dan tidak disuntik hCG.
Kelompok perlakuan kedua yang hanya disuperovulasi sebelum kawin dengan kode SO
1
. Kelompok perlakuan yang ketiga, hanya disuntik hCG hari ke-6 setelah
kawin dengan kode SO
2
. Kelompok perlakuan keempat yang disuperovulasi sebelum kawin dan
disuntik hCG hari ke-6 setelah kawin dengan kode SO
12
.
3.4.2. Superovulasi dan Penyuntikan hCG
Perlakuan diawali dengan sinkronisasi estrus terlebih dahulu terhadap semua domba pada setiap kelompok perlakuan. Sinkronisasi estrus dilakukan
dengan menyuntikkan hormon PGF
2 α
secara intramuskular sebanyak dua kali dengan rentang waktu 11 hari antara penyuntikan pertama dan kedua. Dosis
PGF
2 α
yang diberikan berkisar 5 hingga 15 mgkg per ekor. Perlakuan superovulasi berupa penyuntikan PMSG dan hCG intramuskular dilakukan pada
hari yang sama dengan penyuntikan PGF
2 α
kedua, sesaat setelah penyuntikan PGF
2 α
.
Kira-kira 24 hingga 36 jam pasca penyuntikan PGF
2 α
kedua, domba berada dalam kondisi estrus, kemudian semua kelompok domba perlakuan
dikawinkan dengan domba pejantan yang telah dipilih. Perkawinan dilakukan dengan mencampurkan domba pejantan dan domba betina perlakuan selama 3 hari
dengan membagi 21 ekor domba perlakuan menjadi 4 kelompok dengan masing- masing kelompok terdiri atas 5 hingga 6 ekor domba betina perlakuan ditambah 1
ekor domba jantan. Penyuntikan hCG intramuskular dilakukan 6 hari setelah perkawinan. Pemeriksaan kebuntingan menggunakan USG dilakukan 30 hari
setelah perkawinan.
3.4.3. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel darah dilakukan setiap 3 hari pada awal kebuntingan. Pengambilan darah dilakukan melalui vena jugularis menggunakan spuit sebanyak
kurang lebih 5 mL kemudian langsung dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah diisi antikoagulan EDTA sebelumnya. Tabung tersebut kemudian langsung
ditutup menggunakan sumbat dan diberi label sesuai kode perlakuan. Sampel darah dalam tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam kotak pendingin dan
dibawa ke laboratorium fisiologi untuk dilakukan pemeriksaan darah.
3.4.4. Penghitungan Jumlah Sel Darah Merah, Hematokrit, dan Hemoglobin
Penghitungan jumlah sel darah merah eritrosit dilakukan secara manual dengan metode hemositometer. Penghitungan jumlah sel darah merah diawali
dengan menghisap darah menggunakan pipet eritrosit hingga skala 0,5. Kemudian pipet dibersihkan dari noda darah yang menempel menggunakan tisu. Setelah itu,
ujung pipet dimasukkan ke dalam cairan pengencer NaCl fisiologis 0,9 dan menghisap larutan tersebut sampai batas tera 101. Aspirator dilepas, pipet
diangkat, ujungnya ditutup dengan jempol, dan pangkalnya ditutup dengan jari tengah. Pipet diposisikan mendatar dan dihomogenkan dengan memutar pipet
seperti putaran angka 8. Setelah homogen, tetesan pertama dan kedua dibuang, selanjutnya hasil pengenceran dituangkan ke dalam kamar hitung dengan
menyentuhkan ujung pipet pada tepi kaca penutup. Kemudian, kamar hitung didiamkan beberapa menit agar sel-sel darah merah mengendap pada dasar kamar
hitung. Langkah berikutnya, kamar hitung dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 40 kali. Jumlah sel yang dihitung adalah lima kotak, yaitu
pada keempat sudut dan 1 kotak di bagian tengah. Jumlah sel darah merah yang diperoleh dikalikan dengan 10.000 per mm
3
. Penghitungan
nilai hematokrit
dilakukan menggunakan
Adam Mikrohematocrit Reader. Tabung mikro yang digunakan adalah tabung mikro
dengan panjang 7 cm dan diameter 0,1 mm. Sampel darah diambil dengan menempelkan bagian ujung dari tabung mikro tersebut ke dalam darah. Posisi
ujung tabung mikro membentuk sudut kurang lebih 120º dan bagian ujung tabung yang lain dikosongkan kira-kira 1 cm. Bagian ujung tabung disumbat dan tabung
mikro tersebut selanjutnya disentrifugasi selama 4-5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Hasil sentrifugasi dibaca menggunakan Adam Mikrohematocrit
Reader untuk mendapatkan nilai hematokrit. Penghitungan kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan metode
Sahli. Metode ini dilakukan dengan menambahkan HCl ke dalam tabung kemudian ditambahkan dengan sampel darah dan ditambahkan secara perlahan
sejumlah akuades hingga warna yang terbentuk sama dengan kontrol. Kadar hemoglobin diperoleh dengan membaca skala yang tertera pada tabung Sahli.
3.5. Variabel yang Diamati
Variabel yang diamati dalam penelitian ini yaitu jumlah sel darah merah, nilai hematokrit, dan kadar hemoglobin.
3.6. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode analisis One Way Anova dengan uji lanjutan Duncan untuk melihat pengaruh perlakuan terhadap
variabel.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Sel Darah Merah
Jumlah sel darah merah yang didapatkan dalam penelitian ini sangat beragam antarkelompok perlakuan meskipun tidak berbeda nyata secara statistik.
Pola kenaikan dan penurunan jumlah sel darah merah pada setiap kelompok perlakuan sangat fluktuatif jika dibandingkan dengan hari-hari sebelumnya
sehingga sulit untuk menentukan ada tidaknya kenaikan secara pasti setiap harinya. Pengamatan dilakukan dengan membandingkan jumlah sel darah merah
pada setiap kelompok perlakuan terhadap kelompok kontrol untuk melihat ada tidaknya kenaikan jumlah sel darah merah secara umum pada awal kebuntingan
yang diindikasikan sebagai pengaruh perlakuan berdasarkan nilai sampel yang diambil dan dianalisis setiap 3 hari pada awal kebuntingan seperti yang tersaji
pada Tabel 2.
Tabel 2 Jumlah sel darah merah 10
6
mm
3
domba yang disuperovulasi sebelum kawin dan disuntik hCG hari ke-6 setelah kawin, pada awal kebuntingan.
Hari Perlakuan
Kontrol n=9
SO
1
n=6 SO
2
n=3 SO
12
n=3 1
10,87±3,06
a
11,95±9,97
a
10,54±1,74
a
14,94±4,30
a
3 10,79±3,41
a
15,03±3,56
a
14,04±4,29
a
17,28±9,13
a
6 11,14±2,71
a
10,18±2,85
a
10,41±1,55
a
10,04±2,35
a
9 8,10±3,66
a
10,37±4,96
a
6,46±5,22
a
11,05±3,40
a
12 10,48±1,94
a
11,99±2,26
a
13,40±3,61
a
12,26±5,41
a
15 9,75±3,30
a
12,28±1,02
a
12,37±2,03
a
10,14±1,30
a
30 10,83±2,19
a
10,90±2,33
a
8,91±1,39
a
13,13±4,13
a
Ket: Kontrol: tidak diberi PMSG dan hCG; SO
1
: disuperovulasi sebelum kawin; SO
2
: disuntik hCG hari ke-6 setelah kawin; SO
12
: disuperovulasi sebelum kawin dan disuntik hCG hari ke-6 setelah kawin. Huruf
superscript yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan nilai berbeda nyata p0,05.
Hasil yang didapatkan pada tabel 2, menunjukkan bahwa kelompok perlakuan yang disuperovulasi sebelum kawin SO
1
dan kelompok perlakuan