Pengujian Kemampuan Rizobakteri untuk Menginduksi Ketahanan

Sebanyak 3 tiga isolat rizobakteri yang menunjukkan kemampuan paling baik untuk memacu pertumbuhan bulu akar tanaman padi dan dapat menginduksi ketahanan terhadap penyakit blas diidentifikasi untuk menentukan spesies. Identifikasi diawali dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Uji gram dilakukan untuk menentukan apakah rizobakteri yang diperoleh bersifat gram gegatif atau gram positif. Koloni diwarnai dengan pewarna gram purple cristal selama 1 menit, yodium selama 1 menit, alkohol 90 selama 30 detik dan safranin selama 30-60 detik. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali. Pengujian sifat fisiologis rizobakteri dilakukan menggunakan uji Microbact Oxoid Microbact tm GNB Kits. Biakan rizobakteri yang berumur 18- 24 jam digunakan untuk uji ini. Pertama dilakukan uji oksidasi dengan memasukkan 4 tetes biakan rizobakteri ke dalam lubang tray, ditambahkan 2 tetes minyak mineral ke lubang berwarna hitam. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 o C. Bila positif oksidatif, berwarna biru atau ungu. Untuk kelompok oksidasi positif digunakan Microbact 12E dan 12B, sedangkan untuk kelompok oksidasi negatif hanya menggunakan Microbact 12E. Identifikasi secara molekuler dilakukan dengan mengamplifikasi gen 16S- rRNA dengan PCR. Primer yang digunakan adalah primer universal untuk bakteri berupa forward primer 63f 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ dan reverse primer 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’ Marchesi et al., 1998. Kondiri PCR yang digunakan adalah Pre-PCR pada suhu 94 o C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 92 o C selama 30 detik, annealing primer pada suhu 55 o C selama 30 detik, elongation pada suhu 75 o C selama 1 menit, dan post-PCR pada suhu 75 o C selama 5 menit dengan jumlah siklus sebanyak 30 kali. Pemisahn DNA produk PCR pada elektroforesis mini gel dengan menggunakan agarose 2 bv pada teganagan listrik 50 volt selama 45 menit. Visualisasi dengan thidium bromide dan dilihat di bawah UV transluminator. Sekuensing dilakukan dengan alat Automated DNA sequencer ABI PRISM 377 Perkin Elmer Biosystem, USA. Hasil sekuensing kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan program BLAST-N basic local alignment search tool-nucleotide