UIN Syarif Hidayatullah
Table 4.4 Jarak pita dan bobot molekul gel analisis kapsul
No G.
Sapi mm
G. Babi
mm KSS
mm KSB
mm KSSb
mm Sa1
mm Sa2
mm Sa3
mm Bm
kDa
1 -
- 3,5
- -
3,5 -
3,5 146
2 -
- -
- -
5 5
5 132
3 -
- -
7,5 -
- -
- 112,7
4 -
- -
10 10
- -
- 96
5 12
- 12
- -
12 12
12 84,5
6 13
13 13
13 13
13 13
13 80
7 17,5
- 17,5
- -
17,5 17,5
17,5 59
8 -
18,5 -
18,5 18,5
- -
- 60
9 21
- 21
- -
21 21
21 47
10 22
22 -
22 22
- -
- 37,6
11 -
- 26
- -
26 26
26 34
12 -
- -
29 -
- -
- 28
13 -
- -
31 -
- -
- 24,7
14 -
- -
- -
35 35
35 19
15 -
- -
- 36
- -
- 18
16 39,5
39,5 39,5
39,5 39,5
- -
- 14
17 43
- 43
- -
43 43
43 11,4
18 -
45 -
45 45
- -
- 10
Keterangan : KSS kapsul simulasi gelatin sapi, KSB kapsul simulasi gelatin babi, KSSb kapsul simulasi campuran gelatin babi dan sapi, Sa1
kapsul sampel 1, Sa2 kapsul sampel 2, Sa3 kapsul sampel 3.
4.2 Pembahasan
Sebelum analisis dilakukan terhadap sampel kapsul dilakukan terlebih dahulu optimasi kondisi SDS PAGE dengan menganalisis
perbedaan pemisahan gelatin murni dari sapi dan babi yang telah dihidrolisis dengan enzim pepsin dengan variasi waktu 1 sampai 3 jam,
variasi ini penting mengingat aktifitas pepsin tidaklah tetap Wu et al., 2006. Dari optimasi diperoleh pemisahan protein pada SDS PAGE
menunjukkan pemisahan yang baik setelah dihidrolisis selama 3 jam hasil ini berbeda dengan apa yang diperoleh Hermanto et al 2013 dimana
pemisahan sudah dapat diidentifikasi setelah hidrolisis selama 1 jam. Perbedaan durasi ini terjadi akibat penyimpanan pepsin yang lama
sehingga aktifitas enzimatik pepsin menurun.
UIN Syarif Hidayatullah
Variasi durasi hidrolisis dilakukan untuk melihat hasil pemisahan terbaik dari hasil aktifitas pepsin terhadap protein gelatin. Karena kekuatan
aktifitas enzim tidak tetap maka perlu dilakukan percobaan terhadap aktifitas enzim untuk melihat pemisahan yang dapat memunculkan pita
spesifik dari pemisahan protein gelatin sapi atau babi dimana pita ini secara spesifik hanya dimiliki oleh sapi atau babi. Pada optimasi ini
diperoleh 2 pita spesifik untuk gelatin babi yang timbul setelah hidrolisis selama 3 jam yaitu pita dengan bobot molekul 33 kDa dan 43 kDa.
Variasi terhadap konsentrasi akrilamid sebagai medium juga dilakukan pada proses optimasi dengan konsentrsi 10 dan 12 pada
konsentrasi akrilamid 10 pemisahan protein sudah mulai terlihat hanya saja pemisahan protein pada pita dengan bobot molekul lebih besar dari
50 kDa pita-pita yang diperoleh masih sangat rapat sehingga sangat sulit untuk melihat perbedaannya maka dilakukan percobaan kembali dengan
gel 12 dengan harapan didapati pola pemisahan yang lebih baik. Pada akrilamid dengan konsentrasi 12 pemisahan pita dengan bobot molekul
50 kDa sedikit lebih renggang seperti yang terlihat pada gambar 4.1 sehingga dapat lebih mudah untuk dianalisis.
Pada gambar 4.1 dapat dilihat pada kolom 2 dan 3 protein gelatin yang tidak dihidrolisis memilik bobot molekul yang sangat besar diatas
55 kDa untuk sapi dan diatas 70 kDa untuk gelatin babi . Perbedaan pada pemisahan protein sebelum dihidrolisis ini terjadi karena gelatin yang
dianalissis bukanlah merupakan gelatin yang diperoleh dengan cara ekstraksi yang sama atau dengan tipe yang sama. Gelatin sapi merupakan
gelatin tipe B dimana pada proses ekstraksi dari kolagen asalnya menggunakan hidrolisis basa dimana bobot molekul rata-rata gelatin ini
lebih besar dibandingkan bobot molekul rata-rata gelatin yang dipeloleh dari proses hidrolisis asam tipe A sedangkan babi merupakan gelatin tipe
A Gorgieva dan Kokol, 2011, perbedaan bobot molekul rata-rata dari kedua tipe gelatin inilah yang terlihat pada SDS PAGE.
UIN Syarif Hidayatullah
Walaupun secara kasat mata dapat dilihat perbedaannya namun hasil pemisahan protein gelatin tanpa dihidrolisis tidak dapat menunjukkan
pola pemisahan yang spesifik sehingga masih sangat lemah daya identifikasinya, pada kolom 4 sampai 9 gambar 4.1 merupakan protein
gelatin yang telah dihidrolisis oleh enzim pepsin selama selang waktu tertentu, dapat dilihat bahwa setelah proses hidrolisis hasil SDS PAGE
menunjukkan pola pemisahan yang lebih spesifik khususnya pada protein gelatin babi, pada kolom 5,7, dan 9 terlihat pemisahan protein gelatin babi
ada 9 pita pada pemisahan yaitu 94,6 kDa; 74 kDa; 67,6 kDa; 51,6 kDa; 43 kDa; 33 kDa; 23,7 kDa; 17.3 kDa, 12.8 kDa sedangkan pada kolom 4,
6, dan 8 merupakan protein sapi, walaupun pemisahannya belum sebaik protein babi akan tetapi sudah mulai dapat diidentifikasi seperti pita 84
kDa, 70 kDa, 58 kD, 47 kDa, 18.5 kDa, dan 15 kDa. Tidak seperti protein induknya yang hanya dapat dihidrolisis
dengan enzim kolagenase, gelatin dapat di hidrolisis dengan enzim-enzim proteolitik salah satunya adalah pepsin Gorgieva dan Kokol, 2011.
Namun hasil hidrolisis pepsin sendiri terhadap gelatin efektifitasnya tidaklah optimal pada seluruh tipe gelatin yang ada. Hidrolisis dengan
pepsin membutuhkan kondisi asam Al Janabi et al., 1972. Menurut palashoff 2008 kerja pepsin akan sangat baik jika protein yang
dihidrolisis dalam keadaan terdenaturasi. Sedangkan pada penelitian ini hidrolisis dilakukan pada pH 4,5 pada kondisi ini gelatin babi tipe A
tepat pada titik isoelektriknya sehingga sangat memungkinkan gelatin tersebut dalam keadaan terdenaturasi namun tidak dengan gelatin sapi tipe
B. sehingga pada hasil analisis SDS PAGE pola pemisahan gelatin sapi setelah dihidrolisis tidak sebaik gelatin babi.
Selanjudnya perbedaan besar molekul kedua gelatin ini juga mempengaruhi hasil kerja pepsin terhadap gelatin. Gelatin sapi tipe B
memiliki bobot molekur rata-rata lebih besar dari gelatin babi tipe A Gorgieva dan Kokol, 2011 sehingga sebaran hasil hidrolisis gelatin babi
cenderung tersebar hingga pita dengan BM 50 kDa sehingga dapat
UIN Syarif Hidayatullah
terlihat jelas polanya, sebaliknya gelatin sapi yang memiliki molekul besar walaupun setelah proses hidrolisis pita-pita pemisahan yang muncul
dengan BM 50 kDa masih sangat buram dan hanya 4 pita. Perbedaan pola pemisahan inilah yang terlihat pada hasil analisis dengan SDS PAGE.
Perbedaan profil pemisahan protein gelatin pada SDS PAGE setelah dihidrolisis dapat terjadi karena urutan asam amino penyusun
protein tidak sama tergantung dari spesies asalnya Gorgieva dan Kokol, 2011, sedangkan pepsin sebagai enzim yang di gunakan untuk memotong
protein menjadi fragmen-fragmen rantai polipetida memiliki situs-situs spesifik pemotongan. Pepsin memotong rantai polipeptida dengan
memutus ikatan peptida yang ada pada sisi NH
2
bebas dari asam-asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, triptofan, hidrofobik leusin,
isoleusin, metionin, atau dikarboksilat glutamat dan aspartat Al Janabi et al., 1972. Hasil studi terhadap literature yang ada terdapat sangat
banyak pemotongan rantai polipeptida setelah asam amino hodropobik seperti leusin dan fenilalanin akan tetapi pemotongan sangat jarang terjadi
setelah prolin dan histidin.
Gambar 4.5 Pemotongan pepsin.keterangan : A susunan asam amino
rantai alfa 1 kolagen babi, B susunan asam amino rantai alfa 1 kolagen sapi.
UIN Syarif Hidayatullah
Gambar 4.5 menunjukkan bagaimana terjadinya pemotongan terhadap asam amino dengan panjang yang tidak sama. Hasil studi
literature menunjukkan kemungkinan terjadinya pemotongan rantai polipeptida antara leusin dengan glutamin pada pH 4 adalah 100
palashoff, 2008. Jika situs ini leusin-glutamin kita tempatkan ada rantai polopeptida alpha 1 dari kolagen sapi dan babi sebagai prekusor gelatin
maka akan terlihat bahwa jumlah asam amino hasil pemotongan tidak sama jumlahnya sehingga panjang rantai polipeptida yang dihasilkan akan
berbeda antara protein gelatin sapi dan babi, hal ini secara langsung mempengaruhi bobot molekul fragmen polipeptida yang dihasilkan seperti
yang terlihat di gambar 4.6.
Gambar 4.6 Analisis Pita pemisahan gelatin sapi dan babi. Keterangan : 0
protein marker, 1 pepsin, 2 gelatin sapi sebelum dihidrolisis, 3 gelatin babi sebelum di hidrolisis, 4 gelatin sapi setelah
dihidrolisis selama 1 jam, 5 gelatin babi setelah dihidrolisis 1 jam, 6 gelatin sapi setelah dihidrolisis selama 2 jam, 7
gelatin babi setelah dihidrolisis 2 jam, 8 gelatin sapi setelah dihidrolisis selama 3 jam, 9 gelatin babi setelah dihidrolisis
3 jam.
Selanjutnya analisis terhadap gelatin dari kapsul sampel dilakukan bersamaan dengan kapsul simulasi dari gelatin murni dan gelatin murni
tanpa diproses sebagai kapsul. Kondisi analisis disesuaikan dengan hasil optimasi dan dihidrolisis dengan pepsin selama 3 jam. Pada tahap ini
penentuan pita spesifik dari gelatin kapsul simulasi penting untuk
UIN Syarif Hidayatullah
dilakukan karena pita spesifik ini akan digunakan sebagai acuan pembanding gelatin kapsul sampel untuk penentuan sumber gelatin sampel
tersebut. Pita spesifik ditentukan dengan melihat perbedaan pola pemisahan dari kedua gelatin kemudian dilihat pita pemisahan yang timbul
di salah satu gelatin namun pita tersebut tidak timbul pada pemisahan gelatin jenis lainnya. Pita-pita pemisahan yang muncul di kedua jenis
gelatin bukanlah pita spesifik. Pada penelitian ini diperoleh keberadaan pita yang hanya timbul pada gelatin sapi pada bobot molekul 11,4 kDa; 34
kDa; dan 47 kDa gambar 4.6 kolom 3 dan pita yang hanya timbul pada gelatin babi pada bobot molekul 28 kDa; 24,7 kDa; dan 60 kDa gambar
.4.6 kolom 4 sedangkan pita-pita hasil pemisahan yang lain didapati pada kedua jenis gelatin. Maka pita spesifik untuk gelatin sapi adalah 11,4 kDa,
34 kDa, 47 kDa dan pita spesifik untuk gelatin babi adalah pita 28 kDa, 24,7 kDa dan 60 kDa.
Gambar 4.7 Analisis Pita Pemisahan Protein Gelatin kapsul. Keterangan :
0 protein marker,1 gelatin sapi murni, 2 gelatin babi murni, 3 kapsul simulasi gelatin sapi , 4 kapsul simulasi gelatin
babi, 5 kapsul simulasi campuran gelatin sapi dan babi, 6 kapsul sampel A, 7 kapsul sampel B, 8 kapsul sampel C.
Pada kolom 5 gambar 4.7 adalah kapsul simulasi yang dibuat dari campuran gelatin sapi dan gelatin babi, kapsul ini dibuat dan disertakan
dalam analisa untuk melihat bagaimana pemisahan yang terjadi jika sampel yang dianalisis merupakan gelatin campuran atau gelatin yang
UIN Syarif Hidayatullah
terkontaminasi oleh gelatin jenis lain. Pada penelitian ini diperoleh pemisahan gelatin campuran ini tidak benar-benar identik dengan salah
satu pemisahan dari gelatin sapi maupun gelatin babi. Pada pemisahan gelatin campuran ini pita-pita yang menjadi pita spesifik gelatin sapi sama
sekali tidak muncul akan tetapi ada 2 pita dari gelatin babi yang muncul pada pemisahannya yaitu pita dengan bobot molekul 14 kDa dan 10 kDa
hal ini terjadi diasumsikan karena dalam proses hidrolisis yang terhidrolisis terlebih dahulu oleh pepsin pada campuran gelatin tersebut
adalah gelatin babi seperti yang dijelaskan pada paragraf diatas. Sehingga diasumsikan pada metode ini pemisahan dari gelatin kapsul yang
merupakan campuran gelatin sapi dan babi tidak akan memunculkan pita spesifik gelatin sapi tetapi akan memunculkan pita gelatin babi 14 kDa
dan 10 kDa sebagai penanda adanya kontaminasi gelatin babi pada gelatin campuran tersebut.
Selanjutnya dilakukan analisis terhadap pita-pita pemisahan kapsul sampel dengan membandingkan keberadaan pita-pita spesifik dari
pemisahan gelatin sapi ataupun babi dengan pemisahan protein gelatin kapsul sampel. Dari hasil pembandingan didapati bahwa pada pemisahan
protein gelatin dari kapsul sampel 1, 2, dan 3 terdapat pita yang jelas pada Bm 11,4 kDa; 34 kDa; dan 47 kDa yang merupakan pita spesifik pada
pemisahan protein gelatin sapi dan tidak didapati keberadaan pita spesifik pemisahan gelatin babi sehingga dapat disimpulkan bahwa kapsul sampel
merupakan kapsul yang dibuat dari gelatin yang berasal dari sapi. Dari hasil penelitian ini dapat dilihat bahwa SDS PAGE dapat
digunakan sebagai metode untuk membedakan gelatin sapi dan babi melalui pola pemisahan proteinnya. SDS PAGE selanjutnya juga mampu
untuk membedakan gelatin yang telah diolah menjadi produk lain seperti kapsul. Hanya saja SDS PAGE hanya dapat melakukan pembedaan secara
kualitatif.
37
UIN Syarif Hidayatullah
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
1. Metode SDS PAGE dapat membedakan profil protein gelatin sapi dan
babi hasil hidrolisis. 2.
Pemisahan protein gelatin kapsul keras yang berasal dari sapi memiliki pita spesifik pada Bobot Molekul 47 kDa; 34 kDa; 11,4 kDa dan
protein gelatin kapsul keras yang berasal dari babi memiliki pita spesifik pada Bobot Molekul 37 kDa; 28kDa; dan 14 kDa.
3. Dengan membandingkan pola pemisahan protein diperoleh bahwa
gelatin yang digunakan dalam kapsul sampel diduga adalah gelatin sapi.
5.2 Saran
Perlu diadakan analisis lebih lanjut pada pita-pita hasil pemisahan SDS PAGE dengan menggunakan LCMS sehingga dapat diketahui urutan
rantai asam amino pada masing-masing pita tersebut.