Pembuatan media Mueller Hinton MH Pembuatan Media Brain Heart Infussion BHI Streak plate bakteri Pembuatan suspensi bakteri Uji antibakteri minyak atsiri pala

7

2.3 Uji Sifat Fisik Minyak Atsiri Pala

Uji sifat fisik minyak atsiri pala berupa uji indeks bias, berat jenis minyak atsiri, warna, bentuk dan aroma. Uji dilakukan oleh PT. Eteris Nusantara di Yogyakarta.

2.4 Identifikasi Bakteri

Staphylococcus aureus Secara aseptis diambil biakkan bakteri Staphylococcus aureus lalu diletakkan diatas objek glass yang telah disterilkan, ratakan lalu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Objek glass dipanaskan diatas nyala api spiritus hingga kering lalu ditetesi 3 tetes larutan Gram A pada preparat, diamkan selama 1 menit . Preparat dicuci menggunakan air mengalir hingga warna tepat hilang lalu dikeringkan. Cat Gram B diteteskan diatas objek glass lalu didiamkan selama 1 menit kemudian dicuci menggunakan air mengalir kemudian dikeingkan dengan cara diangin-anginkan. Preparat kemudian ditetesi cat Gram D hingga warna tepat hilang kemudian digenangi dengan cat Gram D selama 1 menit kemudian preparat dicuci menggunakan air mengalir lalu dikeringkan. Hasil pengecatan Gram kemudian diamati menggunakan mikroskop perbesaran kuat 1000x.

2.5 Uji Aktivitas Minyak Atsiri Pala

Myristica fragrans Houtt. 2.5.1 Sterilisasi Alat Peralatan gelas berupa tabung reaksi, Erlenmeyer dan cawan petri yang bersih dan kering dibungkus menggunakan kertas kemudian dimasukkan dalam oven dan disterilkan pada suhu 170˚c selama 1 jam. Alat dan bahan lain yang tidak tahan terhadap pemanasan kering yaitu yellow tips , blue tips , tabung eppendorf, media MH, media BHI dan salin, disterilkan menggunakan pada autoklaf suhu 121˚C selama 15 menit.

2.5.2 Pembuatan media Mueller Hinton MH

Serbuk media MH ditimbang sebanyak 9,54 gram dalam Erlenmeyer 250 mL kemudian ditambahkan akuades hingga 250 mL diaduk dan dipanaskan agar media terlarut. Media yang telah terlarut kemudian disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121˚C. Media yang telah selesai disterilkan kemudian disimpan dalam lemari pendingin.

2.5.3 Pembuatan Media Brain Heart Infussion BHI

Media BHI ditimbang sebanyak 7,4 gram kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 200 mL. Media dilarutkan menggunakan akuades hingga tepat 200 mL. Media yang telah larut kemudian disterilakan menggunakan auto klaf selama 15 menit pada suhu 121˚C. Media kemudian disimpan dalam lemari pendingin. 8

2.5.4 Streak plate bakteri

Stok bakteri Staphylococcus aureus diambil menggunakan ose steril kemudian digoreskan diatas media MH padat di dalam cawan petri. Bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 20 jam.

2.5.5 Pembuatan suspensi bakteri

Kultur bakteri Staphylococcus aureus yang telah ditumbuhkan dalam streak plate diambil 5 koloni tunggal lalu dimasukkan dalam tabung berisi 5 mL media BHI kemudian diberi perlakuan shaker incubator selama 120 menit pada suhu 37˚C. Bakteri yang telah diberi perlakuan shaker incubator kemudian disamakan kekeruhannya menggunakan standar Mc Farland. Jika terlalu keruh maka dilakukan pengenceran menggunakan larutan Salin 0,9.

2.5.6 Uji antibakteri minyak atsiri pala

Media MH yang telah disterilkan dituang ke dalam cawan petri, ditunggu hingga media memadat. Diinokulasikan 150 µ L bakteri S.aureus diatas media MH yang telah memadat, kemudian diratakan menggunakan spreader glass . Pada media dibuat sumuran menggunakan cock borer no. 3. Dimasukkan minyak atsiri seri konsentrasi 50, 25, 12,5 dan 6,25 pala ke dalam sumuran kemudian diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37˚C.

2.6 Pembuatan Sabun Cair Minyak Atsiri Pala