Hewan Uji Pembuatan Ekstrak Daun Jati Belanda Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

Metodologi penelitian ini adalah eksperimental meliputi penyediaan simplisia, pembuatan ekstrak, pengujian farmakologi, dan uji statistik terhadap data hasil percobaan. 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat Alat–alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah aluminium, deck glass, foil, freeze dryer, kertas saring, lemari pengering, Microlab 300 Merck, mikropipet Clinicon, neraca listrik, oral sonde, objek gelas, Swing type centrifuge, seperangkat alat destilasi, penetapan kadar air, perkolator, pisau silet, rotary evaporator , rak tabung reaksi, tabung reaksi, pemotong kuku, dan alat – alat gelas laboratorium.

3.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquadest, Daun Jati Belanda, etanol 96, kloroform, kuning telur, lemak kambing, Natrium Karboksi Metil Selulosa Na-CMC, otak, pakan BR-2, reagensia kolesterol CYPRESS, simvastatin bahan baku, dan toluen.

3.2 Hewan Uji

Marmot jantan 200-400 mg berumur 3 bulan dan sudah dikondisikan selama 2 minggu. Universitas Sumatera Utara 3.3 Penyiapan Simplisia 3.3.1 Pengambilan Bahan Pengambilan bahan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan adalah daun Jati Belanda Guazoma ulmifolia Lamk suku Sterculiaceae yang diperoleh dari Kota Batu Kabupaten Malang Provinsi Jawa Timur.

3.3.2 Pembuatan simplisia

Setelah simplisia di dapat dari Kabupaten Malang, bahan dicuci, ditiriskan, ditimbang,lalu dikeringkan di lemari pengering pada suhu 40 o C, kemudian di timbang lalu di blender kemudian disimpan dalam kantong plastik.

3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan abu total, dan pemeriksaan kadar abu yang tidak larut dalam asam Ditjen POM, 1995.

3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan baik pada daun segar maupun simplisia meliputi bentuk, ukuran, bau, rasa dan warna.

3.4.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik pada daun segar dilakukan dengan membuat irisan tipis secara melintang lalu diletakkan di atas kaca objek yang diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan dipanaskan dengan api kecil lalu ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop. Universitas Sumatera Utara Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia diatas kaca objek yang telah diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian dilihat dibawah mikroskop. Hasil pemeriksaan mikroskop daun segar dapat dilihat di lampiran 6, Gambar 3.3 halaman 30.

3.4.3 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena WHO,1992. Cara kerja : Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen. Hasil pemeriksaan kadar air dapat dilihat di Tabel 3.1 halaman 14. Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan MMI, 1979. Hasil pemeriksaan kadar sari larut dalam air dapat dilihat di Tabel 3.1 halaman 14.

3.4.5 Penetapan Kadar Sari yang Larut dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan MMI, 1979. Hasil pemeriksaan kadar sari larut dalam etanol dapat dilihat di Tabel 3.1 halaman 14.

3.4.6 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada Universitas Sumatera Utara suhu 6000 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Ditjen POM, 1980. Hasil pemeriksaan kadar abu total dapat dilihat di Tabel 3.1 halaman 14.

3.4.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan MMI, 1980. Hasil pemeriksaan kadar abu tidak larut dalam asam dapat dilihat di Tabel 3.1 halaman 14.

3.5 Pembuatan Ekstrak Daun Jati Belanda

Pembuatan ekstrak daun Jati Belanda dilakukan dengan cara perkolasi. Serbuk simplisia 500 g di masukkan kedalam bejana tertutup, ditambahkan etanol 96 sehingga semua simplisia terendam, aduk-aduk dan diamkan selama 3 jam. Pindahkan masa sedikit demi sedikit kedalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan diatas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator,biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perlokasi dihentikan jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Selanjutnya ekstrak cair dipekatkan dengan menggunakan rotavapor, setelah didapat ekstrak kental, kemudian di keringkan di freeze dryer Ditjen POM, 1986. Universitas Sumatera Utara

3.6 Uji Aktivitas Penurunan Kadar Kolesterol

Percobaan efek penurunan kadar kolesterol terdiri dari beberapa tahap yaitu penyiapan bahan, penyiapan hewan uji yang hiperkolesterolemia dan pengujian efek penurun kadar kolesterol.

3.6.1 Penyiapan Bahan

Penyiapan bahan-bahan meliputi suspensi Na-CMC kontrol, bahan uji EDJB, dan suspensi simvastatin pembanding

3.6.1.1 Pembuatan Suspensi Na-CMC 0,5 bv

Sebanyak 0,5 g Na-CMC ditaburkan ke dalam lumpang berisi air suling panas sebanyak 20 ml, ditutup dan dibiarkan selama 30 menit hingga diperoleh massa yang transparan Anief, M. 1995, digerus lalu diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Gohel, M.,dkk. 2009

3.6.1.2 Pembuatan Suspensi Ekstrak Daun Jati Belanda EDJB

Berdasarkan hasil orientasi yang didapat, dosis yang dipakai pada ekstrak daun Jati Belanda diperoleh empat variasi dosis yaitu dosis 50 mgkg BB, 100 mgkg BB, 200 mgkg BB dan 400 mgkg BB .Cara pembuatan suspensi ekstrak : Ekstrak etanol daun Jati Belanda ditimbang masing-masing sebanyak 50 mg, 100 mg, 200 mg, dan 400 mg dimasukkan ke dalam lumpang yang berisi sedikit suspensi Na-CMC 0,5 digerus homogen lalu dicukupkan dengan suspensi Na- CMC 0,5 hingga 10 ml. Universitas Sumatera Utara

3.6.1.3 Pembuatan Suspensi Simvastatin

Sebanyak 50 mg simvastatin digerus dalam lumpang, lalu ditambahkan Suspensi Na-CMC 0,5 sedikit demi sedikit sambil terus digerus hingga homogen lalu dicukupkan dengan suspensi Na-CMC 0,5 hingga 625 ml.

3.7 Penyiapan Hewan Uji yang dibuat Hiperkolesterolemia

Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah marmot jantan yang sehat dan dewasa sebanyak 36 ekor yang terlebih dahulu dikarantina selama satu minggu untuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Kemudian diukur kadar kolesterol awalnya lalu dibuat hiperkolesterolemia dengan cara memberikan makanan induksi kuning telur 1 BB diberikan, serta diberi pakan biasa yang dicampur dengan lemak kambing 15 g 100 g jumlah pakan diberikan selama 14 hari berturut-turut secara oral. Diukur kadar kolesterolnya hasil pada Tabel 4.3 halaman 16 . 3.7.1 Pemberian suspensi CMC-Na, Suspensi EDJB Dan Suspensi Simvastatin pada marmot yang hiperkolesterolemia. Hewan uji dibagi menjadi 6 kelompok dan setiap kelompok terdiri dari 6 hewan uji yaitu : 1. Kelompok A diberikan suspensi Na-CMC 0,5 kontrol negatif 2. Kelompok B diberikan suspensi EDJB dosis 50 mgkg BB 3. Kelompok C diberikan suspensi EDJB dosis 100 mgkg BB 4. Kelompok D diberikan suspensi EDJB dosis 200 mgkg BB 5. Kelompok E diberikan suspensi EDJB dosis 400 mgkg BB 6. Kelompok F diberikan simvastatin sebagai kontrol positif Lalu setiap kelompok marmut ditentukan kolesterol darahnya pada hari ke- 14 dan ke-17. Universitas Sumatera Utara

3.7.2 Pengambilan Darah Marmot

Cara pengambilan darah marmot yaitu terlebih dahulu marmot dipuasakan 10-14 jam. Lalu bulu bulu kaki marmut di pangkas, kemudian kuku kaki marmot disikat dengan sikat gigi basah untuk membuang pasir dan sisa pengotor lainnya. Lalu kaki dan kuku marmot di bersihkan dengan alkohol. Setelah itu kuku marmot di potong dengan pemotong kuku sampai berdarah, kemudian darah yang menetes di tampung dalam tabung reaksi yang bersih sebanyak 1 ml.

3.7.3 Pengambilan Serum Darah Marmot

Darah yang didapat, disentrifugasi selama 10 menit dengan 3000 rpm. Lapisan serum diambil, yaitu lapisan yang berupa cairan. Dipipet serum sebanyak 0,01 ml kemudian dimasukkan kedalam tabung yang berisi reagensia kolesterol 1 ml, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit. Diukur pada alat mikrolab dengan panjang gelombang 546 nm.

3.7.4 Pengujian Efek Penurunan Kadar Kolesterol dari EDJB

Pengujian efek penurunan kadar kolesterol menggunakan empat dosis yang berbeda 50 mgkg BB, 100 mgkg BB, 200 mgkg BB, dan 400 mgkg BB dengan pembanding simvastatin dosis 0,775 mgkg BB marmot dan suspensi Na-CMC 0,5 sebagai kontrol. Pada kondisi hiperkolesterolemia setelah hari ke-14 diberikan obat pada hari ke-15 sampai hari ke-21, dan diberi makanan biasa pakan. Pada hari ke -17 dan hari ke-21 diukur kadar kolesterol darah marmot. Skema prosedur kerja pemberian obat dan pengukuran darah dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 27. Universitas Sumatera Utara

3.8 Analisis Data

Data hasil pengamatan dianalisis secara statistik dengan metode Anava analisis variansi secara manual dengan taraf signifikansi 95. Analisis statistik ini menggunakan program SPSS Statistical Product and Service Solution versi 19. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Simplisia

Hasil determinasi tumbuhan dari UPT Materia Medica Indonesia, Dinas Kesehatan Provinsi Jawa Timur, diketahui bahwa sampel yang diteliti adalah Daun Jati Belanda Guazoma ulmifolia Lamk Suku : Sterculiaceae. Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia daun Jati Belanda diperoleh kadar air 9,90 , kadar sari larut dalam air 25,29 , kadar sari larut dalam etanol 15,56 , kadar abu total 9,77 , kadar abu tidak larut dalam asam 0,37 ,. Hasil penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol memenuhi persyaratan pada Materia Medika Indonesia edisi II, 1978, seperti tercantum dalam Tabel 4.1. Tabel 4.1 Pemeriksaan Penetapan Kadar Simplisia Daun Jati Belanda Jenis Penetapan Hasil Pemerik saan Syarat MMI Ket Kadar air Kadar sari larut dalam air Kadar sari larut dalam etanol Kadar abu total Kadar abu tidak larut dalam asam 9,90 25,29 15,56 9,77 0,37 10,0 7,2 3,7 10,4 2,3 Memenuhi Memenuhi Memenuhi Memenuhi Memenuhi Persyaratan kadar air simplisia tidak lebih dari 10, bila lebih dari 10 akan menyebabkan tumbuhnya jamur yang akan menghasilkan toxin. Kadar sari larut dalam air dan larut dalam etanol bertujuan untuk mengetahui jumlah komponen aktif yang dapat larut dalam air atau etanol. Antara lain dipengaruhi oleh umur tanaman dan tempat tumbuh tanaman. Kadar abu total dan abu tidak Universitas Sumatera Utara