METODE PENELITIAN

3.3. Sampel Percobaan

Sampel percobaan dalam hal ini adalah isolat-isolat bakteri termofil penghasil enzim amilase, yang didapat dari kolam sumber air panas yang ada di sumber mata air panas Penen Sibirubiru.

3.4. Pengambilan Sampel Air Panas

Sampel air panas diambil dari sumber mata air panas, masing-masing pada

3 tempat yang berbeda. Sebelum sampel air diambil terlebih dahulu dilakukan pengukuran parameter fisika dan kimia di lapangan kerja. Parameter yang diukur pertama adalah suhu air di tiap titik pengambilan dengan menggunakan termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam tiap bagian tempat pengambilan sampel dan di catat suhunya. Parameter kedua adalah pH air di tiap titik pengambilan diukur dengan pH meter yang dicelupkan ke permukaan air lalu angka pH yang tertera dicatat. Sampel air diambil dari bagian kolam dengan kedalaman 50 cm dari permukaan air. Sampel air diambil sebanyak 200 ml dari tiap tempat dan dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label. Selanjutnya sampel air di bawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.

3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri

Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri termofil adalah Luria agar (ekstrak yeast 5 g, tripton 5 g, NaCl 5 g, tepung agar 5 g dalam 1 liter aquadest) disterilkan, dituang pada petri steril. Setelah media padat sebanyak 0,1 ml sampel air panas disebar dengan hoki stik pada permukaan agar, diinkubasi

selama 48 jam pada suhu 65 o

C. Tiap sampel air panas dibuat ulangannya 2 kali.

Untuk pemurnian bakteri, tiap koloni bakteri yang tumbuh berbeda pada kultur sebelumnya diambil satu ose dan digores ke tiap cawan petri lain yang mengandung media agar selektif amilolitik (Yeast ekstrak 0,2 %, pepton 0,5 %,

NaCl 0,05 %, MgSO 4 0,05%, CaCl 2 0,015%, tepung agar 2 % dan soluble pati 1%), diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65 o

C. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan biakan tunggal tiap jenis bakteri termofil penghasil amilase yang hidup pada sumber air panas Penen. Setiap isolat murni yang dapat tumbuh diasumsikan dapat menggunakan media yang mengandung pati tersebut. Untuk memastikannya dilakukan uji iodin dengan cara meneteskan iodin pada permukaan agar yang berisi isolat, bila terdapat zona bening pada media mengindikasikan enzim amilase diproduksi oleh isolat sehingga di daerah tersebut amilum sudah dihidrolisis (Cappucino, 1983), sedangkan media yang berwarna biru kehitaman menandakan pati di tempat itu belum terhidrolisis. Sebelum pengujian tiap isolat disiapkan dulu stok kulturnya pada media miring. Hal ini perlu dilakukan karena uji iodin membuat isolat bakteri mati karena larutan iodin bersifat desinfektan (Pelczar & Chan, 1988).

3.6. Pembuatan Stok Kultur

Stok kultur disiapkan dengan cara menggores satu ose dari tiap isolat bakteri yang tumbuh di kultur pemurnian sebelumnya, dalam bentuk media miring dengan komposisi media sama seperti media pemurnian isolat. Kultur diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 65 o

C, selanjutnya disimpan di kulkas untuk stok isolat. Stok kultur ini diremajakan sekali dalam 3 minggu.

3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati

Isolat bakteri disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis sampai kekeruhannya sama dengan kekeruhan Larutan Mac Farland 0,5 standart yang

setara dengan 10 8 CFU. Dari tiap suspensi bakteri diambil 5 µl suspensi dengan menggunakan mikropipet, lalu diteteskan dengan tepat pada bagian tengah cawan

petri yang sudah berisi media agar pati yang disterilkan. Kultur diinkubasi selama

C. Tiap isolat bakteri yang tumbuh pada media pati tersebut ditetesi dengan larutan iodin untuk melihat kemampuan daya amilolitiknya. Isolat yang menghasilkan enzim amilase menghasilkan zona bening pada agar di sekitar koloninya jika ditetesi dengan larutan iodin. Lebar zona bening yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong (Hartuti, 2006). Tiga isolat terbesar zona beningnnya selanjutnya digunakan dalam penelitian ini untuk pengujian parameter aktifitas enzim amilase kasar.

72 jam pada suhu 65 o

3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil

Morfologi isolat bakteri penghasil amilase diamati pada kultur isolat yang dimurnikan. Pengamatan morfologi dari tiap isolat meliputi warna koloni, bentuk koloni dilihat dari atas, permukaan koloni dilihat dari samping dan tepi koloni dilihat dari atas (Cappuccino, 1983).

3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis

Pewarnaan gram dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, diletakkan pada kaca objek yang ditetesi 1 tetes air, disebar, kemudian difiksasi dengan memanaskannya di atas lampu bunsen. Pewarnaan dilakukan dengan kristal violet dengan memiringkan gelas objek. Setelah 1 menit dibilas dengan air perlahan, kemudian diberi gram iodin, setelah itu secepatnya diberi aseton alkohol dan dibilas. Kemudian diteteskan larutan safranin sebagai zat warna tandingan,

dibiarkan satu menit, lalu dibilas dengan air dan dikeringkan perlahan dengan tissue. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop, bentuk dan penataan sel-selnya serta gramnya (Cappuccino, 1983).

Pewarnaan spora dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, difiksasi pada kaca objek, lalu diberikan 2-3 tetes Malachite green, lalu dipanasuapkan selama 5 menit (sampai uap terlihat), didiamkan selama 1 menit, bilas dengan aquadest, diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik, lalu dikeringkan tanpa pamanasan Setelah itu diamati dengan mikroskop, spora berwarna hijau sedangkan bagian sel lainnya berwarna merah (Cappucinno, 1983).

3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik

Uji katalase dilakukan dengan mengambil 2 tetes hidrogen peroksida 3% diletakkan pada kaca objek, satu ose isolat bakteri, diletakkan di atas cairan hidrogen peroksida tersebut. Uji katalase positif ditandai dengan dihasilkannya gelembung udara (Cappuccino,1983).

Uji sitrat dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, digores pada permukaan media Simon Citrat Agar dan dengan ose lurus satu ose isolat bakteri juga ditusukkan ke bagian tengah media sampai ke dasar tabung reaksi.

Media kultur tersebut diinkubasi pada suhu 65 o C selama 48 jam. Uji positif bila media berubah dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).

Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menggores isolat bakteri pada permukaan media miring Triple Sugar Iron agar dan juga ditusuk lurus pada

bagian tengah media. Kultur dinkubasi selama 48 jam pada suhu 65 o

C, lalu diamati perubahan warna media. Uji positif bila terjadi perubahan warna media TSIA dari warna teh menjadi warna oranye atau kuning (Cappuccino, 1983).

Uji gelatinase dilakukan dengan menginokulasikan isolat bakteri dengan cara menusuk cara tegak lurus jarum ose pada bagian tengah media Gelatin, lalu

diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65 o

C, setelah itu kultur media disimpan dalam kulkas selama 15 menit. Uji gelatinase positif ditandai dengan bentuk media yang tetap cair meskipun telah disimpan di dalam kulkas (Cappuccino, 1983).

Uji Motilitas dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri dengan cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah tinggi media Sulfit Indol Motility pada tabung reaksi. Tabung diinkubasi selama 48 jam

pada suhu 65 o

C, setelah itu diperhatikan jejak pergerakan bakteri (Cappuccino, 1983).

3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa

Aktivitas enzim amilase yang akan diuji dari ketiga isolat terpilih diplotkan ke kurva standar glukosa agar dapat diketahui berapa konsentrasi Aktivitas enzim amilase yang akan diuji dari ketiga isolat terpilih diplotkan ke kurva standar glukosa agar dapat diketahui berapa konsentrasi

20 ml, divortex, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Dari tiap hasil absorbansi masing-masing larutan glukosa dengan konsentrasi yang berbeda tersebut dibuat garis regresi yang menunjukkan hubungan linier antara absorbansi dan kadar glukosa (Junaidi, 2008).

3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat

Satu ose kultur bakteri amilolitik dari stok kultur yang berumur 1 hari dimasukkan ke dalam media cair steril untuk perangsang pembentukan amilase. Media cair terbuat dari (gram per liter larutan) 6 peptone, 0,5 KCl, 0,5

MgSO 4. 7H 2 O, 1 pati. Larutan kemudian disterilisasi. Media yang mengandung kultur bakteri diinkubasi pada suhu 65 o C selama 72 jam pada shakerwaterbath

dengan kecepatan 150 rpm (Ajayi, 2007).

3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri

Setelah diinkubasi selama 72 jam, kultur cair bakteri dimasukkan ke dalam tabung centrifuge dan diputar selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm.

Supernatan yang mengandung ekstrak dari enzim amilase kasar diambil dengan mikropipet untuk di uji aktivitasnya (Palmer, 1985).

3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri

Termofil

Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS dengan menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey, 1988). Supernatan dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim. Aktivitas enzim amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang dihasilkan oleh 1 ml filtrat kasar amilase. Satu Unit aktifitas enzim didefenisikan sebagai banyaknya µmol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 ml ekstrak kasar enzim amilase selama masa inkubasi. Untuk melihat besarnya satu unit aktifitas enzim tersebut digunakan rumus: AE = MG x 1000 .............................(Kombong, 2004)

BMg x MI

di mana :

AE = Aktifitas enzim ( Unit/mL filtrat enzim). MG = Miligram glukosa yang dihasilkan dari reaksi hidrolisa pati BMg = Berat Molekul Glukosa = 180 MI = Masa Inkubasi = 20 menit

3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam

waterbath dengan suhu yang bervariasi mulai suhu 40 o C, 50 C, 60 C, 65 C, 70 C,

80 o C selama 20 menit. Untuk blanko disiapkan 2 ml ekstrak amilase kasar dalam tabung uji dan dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit, lalu secepatnya

dimasukkan dalam es selama 5 menit untuk menginaktivasi enzim tersebut. Bagian ini digunakan untuk blanko. Ke dalam tabung blanko ditambahkan juga larutan pati 1% dalam sitrat bufer fosfat pH 6,5, lalu diinkubasi pada suhu yang bervariasi sama dengan sampel enzimnya yang aktif selama 20 menit. Untuk menghentikan reaksi setelah 20 menit, ke dalam tiap tabung uji ditambahkan 2 ml reagen DNS (terbuat dari 1 g 3,5,dinitrosalicyclic acid, 20 ml NaOH dan 30 g sodium potassium tartarate dalam 100 ml larutan). Tabung uji dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit dan ditambahkan air yang didestilasi sebanyak 20 ml. Tiap larutan dalam tabung uji kemudian dideterminasi intensitas warnanya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan dengan kurva standart glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat dengan konsentrasi antara 80–260 µg/ml yang telah dibuat sebelumnya (Junaidi, 2008). Tiap sampel pengujian aktifitas enzim dibuat ulangannya sebanyak tiga kali.

3.16 Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim

Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS (3,5-dinitro salicylic acid) dengan menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey,

1988). Filtrat dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim. Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam sitrat bufer fosfat dengan variasi pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 dan pH 9, Lalu tiap

sampel diinkubasi pada waterbath dengan menggunkan suhu 65 o C selama 20 menit, setelah itu ditambahkan masing-masing 2 ml reagen DNS, dididihkan

selama 5 menit, didinginkan pada air mengalir selama 15 menit, ditambahkan masing-masing aquadest sebanyak 20 ml, divortex dan absorbansinya diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Untuk blanko digunakan enzim yang sudah dinonaktifkan dengan cara dididihkan selama

20 menit lalu didinginkan dengan es selama 5 menit.. Untuk perlakuannya dibuat sama dengan perlakuaan sampel pH yang mau diuji.

3.17. Metode Statistik dan Analisis data

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang bersifat eksperimen dan Non Faktorial dengan menggunakan model persamaan :

= µ + Y τ i + ε ij ..................................(Yitnosumarto, 1991). dimana : Y ij = µg/ml glukosa yang dihasilkan oleh reaksi amilase + pati pada

ij

perlakuan ke-i ulangan ke-j µ = nilai tengah umum τ i = pengaruh perlakuan ke-i ε ij = galat percobaan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j

i = 1, 2, 3, 4,5,6 dalam hal ini adalah suhu perlakuan inkubasi yaitu

40, 50, 60, 65, 70 dan 80 o C untuk perlakuan parameter suhu dan pH4, 5, 6, 7, 8, 9 untuk perlakuan parameter pH substrat ( p)

j = 1,2,3 (n)

Hasil pengamatan karakterisasi makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif hasil uji aktifitas enzim dianalisis varian. Bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat nyata dilanjutkan dengan Uji Duncan Multiple Range Test untuk melihat perbedaan antar perlakuan yang dibuat (Yitnosumarto, 1991).