HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik

Dari isolasi bakteri dari sampel air panas Penen didapatkan 22 isolat masing- masing terdiri dari 5 isolat dari lokasi I (suhu 48 o

C, pH 6,8), 12 isolat dari lokasi II (suhu 55 o

C, pH 6,7). Masing-masing isolat dimurnikan pada media agar pati 1% dan didapatkan hasil 2 isolat amilolitik dari lokasi I, 10 isolat dari lokasi II dan 4 isolat dari lokasi III. Setiap isolat yang dapat dimurnikan dianggap dapat menggunakan pati tetapi untuk memastikan dilakukan uji iodin. Isolat yang mampu menghidrolisis pati menghasilkan zona bening di sekeliling isolat setelah ditetesi iodin (Cappuccino, 1983). Sebelum penetesan iodin dilakukan terlebih dahulu dilakukan karakterisasi morfologis dari koloni, juga dibuat stok kultur untuk ke enam belas isolat yang tumbuh tersebut. Dari hasil uji iodin didapatkan hasil enam belas isolat yang tumbuh itu semuanya dapat menghidrolisis pati.

C, pH 6,8) dan 5 isolat dari lokasi III (suhu 57 o

4.2. Karakterisasi Morfologis dan Uji Biokimia

Enam belas isolat bakteri yang teridentifikasi dapat menghidrolisis pati tersebut, dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya, hasil dapat dilihat pada Tabel 3 di bawah ini:

Tabel 3. Karakter Morfologi dan Sifat Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru

Karakter morfologis

Uji biokimia sederhana

Kode Bentuk

Tepi

Elevasi Warna Bentuk/

GSTS GS K

isolat koloni

koloni

koloni koloni tataan sel

r pSI eCa a oIMlA t m r A a a a t l

se

PN1 tidak beraturan berombak

+ +++ +- + mono, strepto

PN2 bulat

Mono,strepto

PN3 tidak beraturan berombak

mono,diplo

PN4 bulat berombak datar krem pseudobasil

mono, diplo

PN5 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil

+ +++ +- +

mono, diplo

PN6 tidak beraturan rata

datar krem pseudobasil

+ +- + +- -

mono, diplo

PN7 tidak beraturan rata

naik

krem pseudobasil

mono, diplo

Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

Lanjutan Tabel 3 :

PN8 bulat

berombak

datar

krem pseudobasil

- - ++ ++ - mono, diplo

PN9 tidak beraturan berombak naik

krem pseudobasil

+ +++ ++ + mono, diplo

PN10 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil

mono, diplo

- - ++ ++ +

strepto

PN11 tidak beraturan filamen

datar krem pseudobasil

- - ++ ++ +

mono, strepto

PN12 tidak beraturan filamen

datar krem pseudobasil

mono, diplo

PN13 tidak beraturan filamen

datar krem pseudobasil

mono, diplo

PN14 rizoid

berlekuk

datar Putih pseudobasil

+ +++ +- +

Mono, diplo

PN15 rizoid

filamen

datar

krem Kokus/

+ +++ +- - Mono, diplo

PN16 bulat

rata

datar

putih pseudobasil

+ +++ +- + Mono, diplo

Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

Dari hasil pewarnaan gram terlihat isolat amilolitik Penen ini 15 berbentuk batang pendek (pseudobasil) dan satu kokus. Untuk sifat gram 12 isolat gram positif dan 4 isolat bersifat gram negatif. Duabelas dari 16 isolat dapat membentuk endospora, sehingga diduga sebagian besar yang berbentuk basil, gram positif dan endospora positif dan katalase positif tersebut berasal dari genus Bacillus. Bakteri jenis ini mampu bertahan hidup dalam bentuk sel vegetatifnya

sampai suhu 70 o C, pada suhu yang lebih tinggi dari 70 C bakteri ini membentuk endospora (Tarigan, 1988; Pelczar & Chan, 1988).

Hasil uji biokimia pada media Simon Citrat Agar menunjukkan 10 dari 16 isolat amilolitik Penen dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Kemampuan menggunakan sitrat ini ini ditandai oleh berubahnya warna media SCA dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).

Hasil uji biokimia fermentasi karbohidrat dengan media TSIA memperlihatkan 15 dari 16 isolat menunjukkan hasil positif dapat menggunakan media TSIA sebagai sumber karbon. Limabelas isolat tersebut memperlihatkan hasil fermentasi pada bagian atas berwarna merah dan bagian dasar kuning sehingga dari sumber carbon yang tersedia isolat hanya dapat memfermentasi glukosa untuk sumber energinya. Tidak ada di antara limabelas isolat tersebut

yang memproduksi H 2 S karena tidak terjadi pembentukan warna hitam pada bagian dasar media setelah fermentasi 48 jam (Cappuccino, 1983).

Hasil uji motilitas dengan media SIM memperlihatkan 16 isolat tersebut bersifat motil. Hal ini ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri sesudah media yang diinokulasi dengan isolat diinkubasi selama 3 hari.

Hasil uji gelatinase dengan media gelatin agar memperlihatkan 16 isolat dapat menghidrolisis gelatin. Hal ini tampak dari bentuk media gelatin yang sudah diinokulasi dan diinkubasi selama 3 hari lalu sesudah itu disimpan di kulkas selama 30 menit ternyata tetap cair (Cappuccino, 1983).

Hasil uji katalase memperlihatkan 11 dari 16 isolat positif menghasilkan katalase. Hal ini ditandai dengan munculnya gelembung oksigen dari permukaan

isolat ketika ditetesi dengan H 2 O 2 (Cappuccino, 1983).

4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Hasil pengujian hidrolisis pati secara semikuantitatif yang dilakukan terhadap 16 isolat bakteri termofil amilolitik Penen didapatkan data sebagaimana ditunjukkan oleh Gambar 4.1 di bawah ini serta pada Lampiran 9.

PN1 PN2 PN3 PN4 PN5 PN6 PN7 PN8 PN9 PN10PN11PN12PN13PN14PN15PN16 Isolat bakteri

Gambar 5. Diameter zona bening hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase isolat

bakteri termofil

Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil enzim amilase dengan aktifitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi tinggi adalah yang zona beningnya > 26 mm, potensi sedang bila diameter zona beningnya berkisar 14–26 mm dan potensi rendah bila diameter zona beningnya <

14 mm. Zona bening yang terbentuk di sekeliling isolat setelah ditetesi larutan iodin menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut telah menghidrolisis pati di bagian media pati tersebut (Cappuccino, 1983). Dengan demikian berdasarkan kriteria potensi yang dibuat oleh Igarashi et al. (1998) dari 16 isolat bakteri termofil amilolitik Penen tersebut 6 isolat berpotensi rendah yaitu PN10, PN13, PN16, PN8, PN5 dan PN7. Potensi sedang dimiliki oleh 7 isolat yaitu PN2, PN12, PN11, PN6, PN14, PN15, PN3 sedangkan yang berpotensi tinggi ada 3 isolat yaitu PN4, PN1 dan PN9 seperti terlihat pada Gambar 6.

(A) (B) (C)

Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin.

Setelah Inkubasi 72 jam: (A) Isolat PN1 (B) Isolat PN4 dan (C)

Isolat PN9

Dari hasil uji hidrolisis zona bening dipilih tiga isolat terbesar zona beningnya yaitu isolat PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27,33 mm) untuk diuji aktifitas enzim amilase kasarnya.

4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Dari hasil pengujian aktifitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh data besar konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati seperti pada Tabel 4 dan Lampiran 10

Tabel 4. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat

bakteri termofil

konsentrasi

Notasi (°C) ( µg/ml) (Unit/ml)per menit  = 0.05

Isolat Suhu

glukosa

Aktivitas enzim

d Ket : Huruf yang sama pada notasi untuk masing-masing isolat menunjukkan

pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%.

Dari Tabel 4 di atas terlihat aktivitas amilase kasar isolat PN1 dan PN4 optimal pada suhu 60 o

C. Aktivitas PN1 menurun hampir 48% bila suhu inkubasi C. Aktivitas PN1 menurun hampir 48% bila suhu inkubasi

C, demikian juga aktivitas PN4 menurun hampir 43% saat

suhu inkubasi dinaikkan menjadi 65 o C. Aktivitas PN9 optimal pada suhu 65 C, aktivitas enzim ini juga menurun sekitar 48% ketika suhu dinaikkan jadi 70 o C.

Kisaran suhu optimum pada aktifitas enzim kasar dari ketiga isolat tersebut didukung hasil penelitian sebelumnya yang pernah dilakukan terhadap berbagai jenis enzim amilase dimana suhu optimum untuk enzim amilase dari

mikroorganisma termofil berkisar antara 50 o C–70°C (Madi et al., 1987; Bessler et al., 2003; Cordeiro et al., 2002). Beberapa spesies Bacillus yang termofil juga ada

ditemukan menghasilkan enzim amilase yang memiliki aktivitas optimum pada suhu 80°C (Vihinen & Mantsala, 1990; Viara et al., 1993; Carvalho et al., 2008). Dari aktivitas enzim amilase kasar ketiga isolat Penen tetap optimal pada suhu

C, berarti ketiga jenis enzim ini memiliki sifat yang termofilik. Ketiga jenis enzim amilase kasar tersebut memiliki kemampuan untuk tetap melakukan

60 0 C-65

aktivitas kataliknya sampai suhu 80 o

C, walaupun aktivitas tersebut mengalami penurunan pada suhu yang lebih tinggi dari 60 o C (Gambar 7.).

40 50 60 65 70 80 Suhu inkubasi ( o C)

Gambar 7. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat

bakteri termofil

Analisis varians pengaruh suhu inkubasi (Lampiran 10.1) menunjukkan suhu inkubasi mempengaruhi aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1. Uji

Duncan pada Tabel 4 memperlihatkan suhu inkubasi dinaikkan dari dari 40 o C sampai 70 o C berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1

tetapi peningkatan suhu inkubasi dari 70 o C menjadi 80 C menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata.

Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN4 (Lampiran 10.2). Suhu inkubasi menunjukkan pengaruh yang berbeda

nyata untuk kenaikan suhu dari 40 o C hingga 60 C, tetapi kenaikan suhu dari 60 C hingga 80 o C tidak menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata. Pada amilase kasar

isolat PN4 perubahan suhu dari 65 o C - 80 C juga tidak berbeda nyata seperti ditunjukkan pada Tabel 4.

Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim isolat PN9 ketika dilakukan Analisa Varian seperti pada Lampiran 10.3 Uji pengaruh variasi suhu

seperti pada Tabel 4 menunjukkan jika kenaikan suhu inkubasi dari 40 o C – 60 C

menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata, tetapi kenaikan suhu dari 60 C menjadi 65 o C tidak menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Aktivitas kembali

berbeda bila suhu dinaikkan dari 60 o C menjadi 70

C, tetapi kenaikan suhu dari

70 o C menjadi 80 C tidak menunjukkan perbedaan nyata. Bila dibandingkan aktivitas amilase kasar berdasarkan variasi suhu

inkubasi enzimatik dari ke tiga isolat Penen tersebut maka dengan masa inkubasi selama 20 menit pada suhu 60 o C enzim amilase PN4 ternyata menghasilkan

glukosa terbanyak (437,22 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN1 (352,84

µg/ml) dan amilase PN9 (328,37 µg/ml), tetapi pada suhu inkubasi enzimatik yang tertinggi digunakan dalam penelitian ini yaitu suhu 80 o C enzim amilase

PN10 menghasilkan glukosa terbanyak yaitu 165,78 µg/ml, PN4 (129,19 µg/ml) dan PN1 (117,38 µg/ml). Dengan demikian terlihat jika amilase PN9 relatif lebih toleran terhadap suhu tinggi.

Berdasarkan hasil yang diperoleh aktivitas enzim amilase kasar dari isolat bakteri termofil Penen lebih tinggi dibandingkan oleh aktivitas amilase kasar yang didapatkan dari isolat bakteri termofil yang berasal dari lumpur panas Lapindo

(Junaidi, 2008) yang pada suhu inkubasi 40 o C hanya berkisar antara 135 - 75 µg/ml. Aktivitas amilase kasar isolat Penen ini menunjukkan aktivitas yang lebih

tinggi dibandingkan aktivitas amilase kasar dari Thermus sp. (Fu-Shaw et al., 1995) yang besarnya 3,5 unit/ml untuk masa inkubasi 1 jam (0,058 Unit/ml untuk

per menit ) pada suhu inkubasi 60 o C ataupun yang pernah didapatkan dari amilase kasar isolat limbah buangan pabrik ubi oleh Oboh (2005) yang besarnya 2,2

unit/ml untuk masa inkubasi 30 menit (0,07 Unit/ ml per menit). Mikroorganisma termofil dapat menghasilkan enzim yang memiliki aktivitas pada suhu yang tinggi melebihi enzim dari mikroorganisma mesofil karena 3 komponen perlengkapan yang dimiliki oleh mikroorganism termofil itu sendiri pertama berupa protein yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan proteolisis (Kumar & Nussinov, 2001). Protein ini dikenal dengan nama Chaperonins yang dapat membantu mikroorganisma termofil mengembalikan fungsi aktivitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu yang tinggi (Everly & Alberto, 2000). Kelebihan kedua mikroorganisma termofil memiliki membran sel

yang terbuat dari struktur lipid yang resisten terhadap suhu tinggi sehingga mampu untuk hidup di lingkungan bersuhu tinggi (Herbert & Sharp, 1992; de Rosa et al., 1994). Komponen ketiga yang dimiliki oleh mikroorganisma termofil adalah suatu struktur DNA yang disebut Reverse DNA Gyrase yang menghasilkan suatu bentuk superkoil yang bermuatan positif sehingga DNA memiliki titik leleh yang lebih tinggi dari pada titik leleh DNA pada mikroorganisma non termofil. Selain kemampuan mikroorganismanya maka enzim termofil ini juga memiliki perangkat genetik yang membuatnya memiliki daya katalis pada suhu tinggi. Perangkat genetik tersebut menyangkut komposisi asam amino arginin dan tirosin yang meningkat pada protein enzimnya, jumlah ikatan hidrogen dan salt bridge yang meningkat pada struktur protein enzimnya dan struktur komformasi -helix dari protein enzim (Kumar et al., 2000).

4. 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

Dari hasil pengujian aktivitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh hasil konsentrasi glukosa hasil hidrolisis pati seperti terlihat pada Tabel 5 dan Lampiran 10.4-10.6

Tabel

5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat

Bakteri Termofil konsentrasi

Isolat pH

glukosa

Notasi ( µg/ml) (Unit/ml per menit)  = 0.05

Aktivitas enzim

Keterangan: Huruf yang sama pada notasi dari masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%.

Amilase dari isolat PN1 menunjukkan aktivitas optimumnya pada pH 8. Aktifitas optimum pada pH 8,0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat Bacillus sp strain SMIA-2 (Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat Bacillus sp KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan pada pH 10,0 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001). Aktifitas enzim PN1 meningkat mulai dari pH 4 sampai pH 8 hal ini menunjukkan jika amilase isolat PN1 lebih cocok digunakan pada pH lingkungan yang sifatnya Amilase dari isolat PN1 menunjukkan aktivitas optimumnya pada pH 8. Aktifitas optimum pada pH 8,0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat Bacillus sp strain SMIA-2 (Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat Bacillus sp KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan pada pH 10,0 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001). Aktifitas enzim PN1 meningkat mulai dari pH 4 sampai pH 8 hal ini menunjukkan jika amilase isolat PN1 lebih cocok digunakan pada pH lingkungan yang sifatnya

Dari data yang diperoleh ternyata enzim amilase kasar isolat PN4 aktivitas optimumnya berada pada pH 6,0. Aktivitas optimum di pH 6,0 ini juga dijumpai pada enzim amilase dari isolat bakteri Thermus sp. (Fu-Shaw et al., 1995), dan enzim dari isolat limbah pabrik tapioka (Oboh, 2005). Aktivitas amilase isolat PN4 ini meningkat mulai dari pH 4–6 tetapi mulai mengalami penurunan sekitar 21% ketika pH menjadi 7. Penurunan aktivitas terus terjadi sampai pH 8, dengan aktivitas enzimnya menurun sebesar 58% dibandingkan pada saat aktivitas optimumnya. Analisis varians menunjukkan pH berpengaruh sangat nyata pada aktivitas amilase PN 4 (Lampiran 10.5). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan aktivitas enzim pada pH 4,0 tidak berbeda nyata dengan aktivitas enzim pada pH 8,0, demikian juga dengan aktivitas enzim pada pH 5,0 tidak berbeda nyata dengan pada pH 7,0.

Isolat PN9 menghasilkan enzim amilase kasar yang aktifitas optimumnya pada pH 7,0. Aktivitas optimum pada pH ini pernah ditemukan pada enzim amilase dari isolat Clostridium thermosulforogenes (Swamy & Seenayya, 1996), juga pada isolat Bacillus licheniformis (Haq et al., 2005), juga pada amilase dari isolat Bacillus amyloliquefaciens (Syu & Chen, 1997). Aktivitas amilase isolat

PN9 ini menunjukkan peningkatan dari pH 4,0 sampai pH 7,0, tetapi mulai terjadi penurunan sebesar 38% ketika pH meningkat menjadi 8. Aktivitas terus menurun sebesar 65 % dari aktivitas optimumnya dengan peningkatan pH sampai 9,0. pH substrat berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN9 (Lampiran 10.6). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan aktivitas enzim amilase kasar PN9 berbeda nyata ketika pH substrat berubah dari pH 5,0 menjadi 6,0 dan pada pH 8,0 serta 9,0 aktifitas juga menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Hal ini menunjukkan enzim amilase dari isolat PN9 ini lebih cocok digunakan pada pH yang cenderung netral untuk mendapatkan hasil yang optimum.

Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase kasar ketiga isolat tersebut dapat dilihat pada Gambar 8 di bawah ini

Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat

Bakteri Termofil

Dari grafik terlihat jika pada pH yang paling rendah (pH4) aktivitas amilase terbesar untuk 20 menit masa inkubasi tenyata PN9 menghasilkan glukosa terbanyak (267,31 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN4 (117,53 µg/ml) dan Dari grafik terlihat jika pada pH yang paling rendah (pH4) aktivitas amilase terbesar untuk 20 menit masa inkubasi tenyata PN9 menghasilkan glukosa terbanyak (267,31 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN4 (117,53 µg/ml) dan

Bila dibandingkan dengan tempat hidup alami dari isolat Penen ini yang berkisar pada pH 6,7-pH 6,8 maka kemampuan enzim untuk melakukan aktifitas kataliknya yang optimum tidak berbeda jauh dengan kondisi pH pada pengujian di laboratorium dimana pH optimum PN4 pH optimumnya 6,0, PN9 optimum pada pH 7,0, tetapi PN1 ternyata memiliki sifat alkalitoleran yang cukup baik untuk aktifitas optimumnya pada pH 8,0.

Secara keseluruhan enzim amilase kasar ketiga isolat Penen ini masih dapat melakukan aktifitas kataliknya dari pH 4,0 juga sampai pH 9,0. Hal ini terjadi karena mikroorganisma dari kelompok termofil umumnya memiliki kelengkapan sel yang lebih baik agar dapat hidup lebih toleran terhadap perubahan pH lingkungan. Kelengkapan sel ini terutama dijumpai pada muatan ion yang tinggi pada membran selnya yang berhubungan dengan kemampuannya mengembangkan daya toleransi menghadapi peningkatan pH lingkungan (Ulukanli, 2002) yang ekstrim. Mikroorganisma ekstremofil ini juga umumnya menghasilkan enzim yang sifatnya toleran menghadapi perubahan pH lingkungan reaksi kimia kataliknya.