direndam kembali dalam larutan Na-hipoklorit 20 selama 30 menit, kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali. Setelah proses sterilisasi
dilakukan, biji diletakkan di cawan petri steril, kemudian dipotong menjadi dua bagian. Bagian yang tidak terdapat embrio dibuang, sedangkan bagian yang
terdapat embrio ditanam pada media Murashige dan Skoog MS tanpa zat pengatur tumbuh ZPT, dan dibiarkan tumbuh selama satu minggu tanpa
subkultur.
Induksi kalus embriogenik
Eksplan hipokotil dan daun diambil dari kecambah berumur 1 minggu setelah tanam pada media MS, sedangkan aksis embrio tua dan kotiledon
berasal dari biji yang telah dikupas dan disteril. Hipokotil dan daun dipotong- potong dengan ukuran 0.5 cm, aksis embrio tua ± 0.3 cm dan kotiledon ± 0.5
cm Gambar 3, kemudian ditanam pada media MS padat dengan sukrosa 3 yang ditambahkan zat pengatur tumbuh picloram 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5
mgL
-1
dan 2.4 D 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
. Kultur diinkubasi di tempat gelap, pada suhu 26±2°C, selama 8 minggu.
Gambar 3. Eksplan J. curcas komposit IP3-P a eksplan daun, b eksplan hipokotil, c eksplan aksis embrio dan d eksplan kotiledon
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi zat pengatur
b a
d c
tumbuh dengan 6 taraf yaitu: 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
Picloram, sedangkan faktor kedua adalah jenis eksplan dengan 4 taraf yaitu: daun,
hipokotil, aksis tua dan kotiledon. Setiap perlakuan diulang 10 kali, tiap botol berisi 2 eksplan sehingga totalnya yaitu 240 satuan percobaan.
b. Induksi embrio somatik dari aksis embrio muda dan embrio muda J.
curcas aksesi Dompu
Sterilisasi Pada sterilisasi aksis embrio muda dan embrio muda Gambar 4, buah
berukuran 27-30 mm direndam dalam larutan Na-hipoklorit 25 selama 30 menit, kemudian larutan Na-hipoklorit dibuang dan buah dipotong kemudian
embrio muda dipisahkan dari endosperm. Setelah terpisah embrio muda berukuran 11.5-15.0 mm dipindahkan ke media perlakuan.
Gambar 4. Eksplan a aksis embrio muda dan b embrio muda.
Induksi kalus embriogenik
Eksplan aksis embrio buah muda dan embrio muda ditanam pada media perlakuan setelah biji disterilisasi yaitu pada media MS padat dengan sukrosa
3 yang ditambahkan zat pengatur tumbuh picloram 0.0; 0.5; 1.0; 1,5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
dan 2.4 D 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
. Kultur diinkubasi ditempat gelap, pada suhu 26±2°C, selama 8 minggu.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan dua faktor. Faktor pertama adalah konsentrasi zat pengatur
tumbuh dengan 11 taraf yaitu: 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
picloram dan 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
2.4-D, sedangkan faktor kedua adalah jenis eksplan dengan 2 taraf yaitu: aksis embrio muda dan embrio muda. Setiap
2 mm 2 mm
a b
perlakuan diulang 8 kali, tiap botol berisi 2 eksplan, sehingga totalnya yaitu 176 satuan percobaan.
Pengamatan percobaan 1a dan 1b dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan dan perkembangan kalus yang terbentuk mulai dari 1-8 minggu.
Pengamatan meliputi : 1.
Jumlah eksplan membentuk kalus Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 minggu setelah tanam
MST. Persentase eksplan membentuk kalus =
Σ eksplan berkalus X 100
Σ eksplan yang digunakan 2.
Pertumbuhan kalus Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 minggu setelah tanam
MST. Pengamatan dilakukan dengan sistem skoring Gambar 5. Skoring pertumbuhan kalus:
Skor 1: eksplan tidak membentuk kalus Skor 2 : 1-25 kalus menutupi eksplan
Skor 3 : 26-50 kalus menutupi eksplan Skor 4 : 51-75 kalus menutupi eksplan
Skro 5 : 76-100 kalus menutupi eksplan
Gambar 5. Skor perkembangan kalus dari eksplan daun a skor 1, b skor 2, c skor 3, d skor 4, dan e skor 5.
a b
c d
e
3. Morfologi kalus struktur dan warna.
Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST. Pengamatan dilakukan dengan cara melihat struktur dan warna kalus.
4. Jumlah eksplan membentuk embrio somatik
Persentase eksplan membentuk embrio somatik = Σ eksplan membentuk embrio somatik X 100
Σ eksplan yang berkalus
c. Induksi embrio somatik dari aksis embrio buah masak J. curcas aksesi
Dompu dengan picloram dan 2.4-D
Eksplan aksis embrio buah masak ditanam pada media perlakuan setelah biji disterilisasi Gambar 6, pada media MS padat dengan sukrosa 3 yang
ditambahkan zat pengatur tumbuh picloram 0.0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
- 1
dan 2.4 D 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
. Kultur diinkubasi di tempat gelap, pada suhu 26±2°C, selama 8 minggu.
Gambar 6. Sumber eksplan a buah jarak masak hijau dan b aksis embrio buah masak hijau tanda panah.
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 1 faktor yaitu konsentrasi zat pengatur tumbuh dengan 11 taraf
yaitu: 0.0; 0.5; 1; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
Picloram dan 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 dan 2.5 mgL
-1
2.4-D. Setiap perlakuan diulang 10 kali, tiap botol berisi 2 eksplan, sehingga totalnya yaitu 110 satuan percobaan.
Pengamatan dilakukan untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan kalus yang terbentuk 1-8 minggu.
Pengamatan meliputi : 1.
Jumlah eksplan membentuk kalus Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST.
b a
Persentase eksplan membentuk kalus = Σ eksplan berkalus
X 100 Σ eksplan yang digunakan
2. Pertumbuhan kalus
Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST. Pengamatan dilakukan dengan sistem skoring.
Skoring pertumbuhan kalus: Skor 1: eksplan tidak membentuk kalus
Skor 2 : 1-25 kalus menutupi eksplan Skor 3 : 26-50 kalus menutupi eksplan
Skor 4 : 51-75 kalus menutupi eksplan Skor 5 : 76-100 kalus menutupi eksplan
3. Morfologi kalus struktur dan warna
Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST. Pengamatan dilakukan dengan cara melihat struktur dan warna kalus.
4. Jumlah eksplan membentuk embrio somatik
Persentase eksplan membentuk embrio somatik = Σ eksplan membentuk embrio somatik X 100
Σ eksplan yang berkalus 5.
Histodiferensiasi irisan tentang tahap-tahap perkembangan embrio somatik
d. Induksi embrio somatik dari aksis embrio buah masak J. curcas aksesi
Dompu dengan picloram
Eksplan aksis embrio buah masak ditanam pada media perlakuan setelah biji disterilisasi, pada media MS padat dengan sukrosa 3 yang
ditambahkan zat pengatur tumbuh picloram 2.5; 3.0; 4.0 dan 2.5 mgL
-1
. Kultur diinkubasi di tempat gelap, pada suhu 26±2°C, selama 8 minggu.
Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL 1 faktor yaitu konsentrasi picloram, dengan 4 taraf yaitu: 2.5; 3.0; 4.0 dan 2.5
mgL
-1
. Setiap perlakuan diulang 3 kali, tiap Petri dish berisi 6 eksplan, sehingga totalnya 12 satuan percobaan.
Pengamatan dilakukan untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan kalus yang terbentuk mulai dari 1-8 minggu.
Pengamatan meliputi : 1.
Persentase eksplan membentuk kalus Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST.
Persentase eksplan membentuk kalus = Σ eksplan berkalus
X 100 Σ eksplan yang digunakan
2. Pertumbuhan kalus
Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST. Pengamatan dilakukan dengan sistem skoring.
Skoring perkembangan kalus: Skor 1: eksplan tidak membentuk kalus
Skor 2 : 1-25 kalus menutupi eksplan Skor 3 : 26-50 kalus menutupi eksplan
Skor 4 : 51-75 kalus menutupi eksplan Skro 5 : 76-100 kalus menutupi eksplan
3. Morfologi kalus struktur dan warna
Pengamatan dilakukan setiap minggu sampai 8 MST. Pengamatan dilakukan dengan cara melihat struktur dan warna kalus.
4. Jumlah eksplan membentuk embrio somatik
Persentase eksplan membentuk embrio somatik = Σ eksplan membentuk embrio somatik X 100
Σ eksplan yang berkalus 5.
Histodiferensiasi irisan tentang tahap-tahap perkembangan embrio somatik dari globular, hati, torpedo dan kotiledon
Pengamatan secara mikroskopik dengan membuat irisan contoh menurut metode parafin Sass, 1951 Lampiran 2, hanya dilakukan untuk
embrio somatik yang terbentuk yaitu dengan irisan membujur. Pembuatan preparat melalui beberapa tahapan, yaitu fiksasi, dehidrasi, infiltrasi
pemblokan, embedding, pengirisan dan staining pewarnaan. Pewarna yang dipergunakan adalah fast green.
2. Proliferasi dan Pendewasaan Kalus Embriogenik
a. Proliferasi dan pendewasaan kalus embriogenik pada media padat Kalus embriogenik dan embrio somatik yang terbentuk pada media
Picloram atau 2.4-D disubkultur ke media MS padat tanpa zat pengatur tumbuh dengan penambahan 3 sukrosa, vitamin Gamborg B5 dan
phytagel 2 gL
-1
. b. Proliferasi dan pendewasaan kalus embriogenik pada media cair
Kalus embriogenik dan embrio somatik yang terbentuk pada media dengan penambahan picloram atau 2.4-D disubkultur ke media MS padat
tanpa zat pengatur tumbuh dengan penambahan 3 sukrosa, vitamin Gamborg B5 selama 2 minggu, kemudian disubkultur ke media cair tanpa
atau dengan penambahan 2.5 mgL
-1
picloram. Pengamatan meliputi :
1. Jumlah kalus embriogenik
2. Jumlah embrio somatik yang terbentuk
3. Jumlah embrio somatik yang bertunas
4. Deskripsi histodiferensiasi
D. Analisis Statistik
Percobaan 1a dan 1b menggunakan percobaan acak lengkap dengan dua faktor, sedangkan percobaan 1c dan 1d menggunakan percobaan acak lengkap
dengan satu faktor. Data dianalisis dengan menggunakan Analysis of Variance ANOVA untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Perlakuan yang
berpengaruh nyata kemudian diuji lanjut dengan menggunakan Duncan’s multiple
range test DMRT dengan tingat kepercayaan 5. Data skoring diuji menggunakan uji peringkat Kruskal Wallis Walpole 1995.
Model statistik percobaan acak lengkap dengan dua faktor percobaan 1a dan 1b menurut Mattjik dan Sumertajaya 2006, yaitu:
Y
ijk
= μ + α
i
+ β
j
+ αβ
ij
+ ε
ijk
Dimana, i = 1,2…,r; j=1,2…,r; k=1,2…r
Y
ijk
= Nilai pengamatan pada faktor pertama taraf ke-1 faktor kedua taraf ke-j dan ulangan ke-k
μ = Rataan umum α
i
= Pengaruh utama Faktor pertama β
j
= Pengaruh utama Faktor kedua αβ
ij
= Pengaruh interaksi faktor pertama ke-i dan faktor kedua ke-j ε
ijk
= Pengaruh galat untuk pengamatan taraf ke i,j,k Model statistik percobaan acak lengkap dengan satu faktor percobaan 1c
dan 1d menurut Mattjik dan Sumertajaya 2006, yaitu: Y
ij
= μ + τ
i
+ ε
ij
Dimana, i = 1,2…,r dan j=1,2…,r
Y
ijk
= Nilai pengamatan pada faktor pertama taraf ke-1 dan ulangan ke-j μ = Rataan umum
τ
i
= Pengaruh perlakuan ke-i ε
ij
= Pengaruh galat untuk pengamatan taraf ke i,j
