10¯
4
, 10¯
5
, 10¯
6
dan 10¯
7
. Suspensi diinokulasikan sebanyak 0,1 ml dari masing- masing pengenceran dan disebar ke media SMA. Kultur diinkubasi selama 24-48
jam pada suhu 30 ºC. Uji positif ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni Lampiran 3 halaman 30. Koloni yang membentuk zona bening
diamati dan dikarakterisasi warna, bentuk, tepi dan elevasi koloni Lampiran 4 halaman 31. Kemudian dimurnikan di dalam media SMA miring di dalam tabung
reaksi dan disimpan sebagai stok kultur isolat Widyaastuti Dewi, 2001. Uji biokimia dilakukan terhadap isolat mencakup uji pati, uji sitrat, uji gelatin, uji
motilitas, uji sulfida, dan uji katalase serta pewarnaan sifat gram Cappucino Sherman, 1983.
3.4 Uji Aktivitas Proteolitik Secara Kualitatif
Suspensi bakteri yang memiliki nilai OD
600nm
=0,5 dipipet sebanyak 10 µl di atas kertas cakram steril lalu dipindahkan ke media SMA. Isolat diinkubasi pada
suhu 30 ºC selama tiga hari dan dilakukan pengukuran setiap harinya. Aktivitas proteolitik diukur sebagai indeks proteolitik dengan membandingkan diameter
zona bening dengan diameter koloni bakteri Lampiran 5 halaman 32.
3.5 Isolasi Bakteri Pada Media Feather Meal Agar
Bulu ayam yang telah direndam selama satu malam dengan aseton kemudian dikeringkan. Bulu ayam ditumbuk halus hingga teksturnya menjadi
bubuk. Media FMA dibuat dengan mencampurkan bubuk bulu ayam sebanyak 5 g, agar 10 g, NaCl 0,25 g, KH
2
PO
4
0,35 g, K
2
HPO
4
0,7 g, MgSO
4
0,05 g dan ekstrak yeast 0,5 g dalam 500 ml akuades. Media FMA dipanaskan di atas hot
plate hingga homogen dan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 20 menit. Sebanyak satu ose bakteri yang membentuk zona bening pada
media SMA, diinokulasikan ke media FMA dengan menggunakan metode cawan gores lalu diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 30 ºC. Uji positif ditandai
dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni Agrahari Wadhawa, 2010.
3.6 Uji Aktivitas Keratinolitik Secara Kualitatif
Suspensi bakteri yang memiliki nilai OD
600nm
=0,5 dipipet sebanyak 10 µl diatas kertas cakram steril lalu dipindahkan ke media FMA. Isolat diinkubasi pada
suhu 30 ºC selama satu minggu dan dilakukan pengukuran setiap harinya. Aktivitas keratinolitik diukur sebagai indeks keratinolitik dengan membandingkan
diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri Lampiran 6 halaman 33.
3.7 Pengukuran Potensi Bakteri Keratinolitik
Bulu ayam dan rambut kambing sebagai limbah keratin yang telah dipotong- potong kecil ditimbang masing-masing sebanyak 0,5 g, dimasukkan ke dalam
botol yang telah berisi 45 ml media garam cair NaCl 0,25 g, K
2
HPO
4
0,7 g, KH
2
PO
4
0,35 g, MgSO
4
0,05 g dan yeast ekstract 0,5 g dalam 500 ml akuades sebanyak 45 ml Lampiran 1 halaman 28, kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 121 ºC selama 20 menit. Sebanyak 5 ml suspensi bakteri keratinolitik hasil isolasi dengan OD 0,5 OD
600
=0,5 diinokulasikan ke dalam botol yang berisi limbah keratin dan media garam cair yang sudah disterilkan,
kemudian diinkubasi selama 25 hari pada suhu 30 ºC dan setiap harinya botol diguncang. Pada hari terakhir inkubasi, kultur disaring dengan kertas saring dan
dikeringkan selama 24 jam di dalam oven. Kontrol disiapkan dengan perlakuan yang sama, pada botol yang berisi limbah keratin dan media garam cair tetapi
tanpa penambahan isolat bakteri. Kemampuan isolat dalam mendegradasi keratin dievaluasi dengan menimbang berat kering keratin sisa degradasi hari ke-25 dan
berat kering keratin awal hari ke-0, dengan menggunakan rumus persentase penurunan berat kering sebagai berikut:
Lampiran 7 halaman 34 BK awal – BK akhir
Penurunan berat kering = x 100
Bk awal Untuk melihat peptida atau asam amino terlarut, masing-masing filtrat
hasil sisa penyaringan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur optical density pada
spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 280 nm Lampiran 8 halaman
35. Pertumbuhan isolat selama pengamatan diukur dengan metode Total Plate Count TPC pada hari pengamatan 0 hari, hari ke-10 dan hari terakhir 25
hari. Pengulangan dilakukan sebanyak 2 kali untuk setiap perlakuan isolat bakteri. Untuk perhitungan estimasi jumlah sel dapat dihitung dengan rumus:
Lampiran 9 halaman 36 1
Estimasi Jumlah Sel = Jumlah Koloni x CFUml
Faktor Pengenceran
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
