Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Bacillus cereus ATCC 13091
diperoleh dari Departemen Kesehatan Masyarakat Veteriner, Institut Pertanian Bogor. Bakteri-bakteri ini disegarkan dalam Nutrien Agar, sedangkan Vibrio
harveyi disegarkan dalam medium sea water complete SWC
4 Peralatan Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari peralatan untuk
kultivasi Chaetoceros gracilis erlenmeyer, akuarium, pompa udara, lampu dan sebagainya, peralatan untuk pemanenan biomasa filter keramik, pompa, freeze
dryer dan sebagainya serta alat untuk ekstraksi komponen aktif vortex,
magnetic stirrer , evaporator dan sebagainya. Selain itu juga digunakan
peralatan untuk analisis aktivitas antibakteri inkubator, clean bench, oven sterilisasi, autoklaf, refrigeraor dan sebagainya, peralatan untuk analisis
kerusakan bakteri sentrifus, refrigerator, freezer dan sebagainya, peralatan untuk analisis morfologi sel bakteri mikroskop elektron serta beberapa
peralatan untuk analisis kandungan kimia HPLC, GC, AAS, Gen Quant.
3.3 Tahapan Penelitian dan Analisis
Penelitian ini dibagi menjadi empat percobaan, yaitu: 1 Kultivasi Chaetoceros gracilis dalam medium NPSi
2 Ekstraksi, uji aktivitas dan stabilitas senyawa antibakteri dari ekstrak Chaetoceros gracilis
3 Analisis kerusakan bakteri setelah kontak dengan ekstrak Chaetoceros gracilis
4 Analisis komposisi kimia dari biomasa Chaetoceros gracilis.
3.3.1 Kultivasi Chaetoceros gracilis dalam medium NPSia
Tahap 1 Kultivasi mikroalga C. gracilis Mikroalga ditumbuhkan pada medium NPSi dalam flask yang dilengkapi
dengan aerasi terus menerus, lampu neon 20 Watt 2500 lux yang dinyalakan terus menerus dan dilakukan pada ruangan dengan suhu 25 -26
o
C. Komposisi medium NPSi disajikan pada Lampiran 1.
Tahap 2 Pemanenan Chaetoceros gracilis Kultur Chaetoceros gracilis dipanen pada hari ke 7 untuk dipisahkan
biomasanya. Pemanenan dilakukan menggunakan filter keramik pori 0,3 µm. Biomasa yang diperoleh selanjutnya dikeringkan menggunakan freeze dryer.
Produksi biomasa sel ditentukan dengan menghitung berat biomasa kering. Analisis rendemen biomasa Chaetoceros gracilis dilakukan dengan menghitung
rendemen biomasa dengan cara membagi berat kering tersebut dengan volume panen kultur.
Tahap 3 Penentuan kurva pertumbuhan Chaetoceros gracilis Penghitungan sel dalam kultur dilakukan dengan cara melakukan
sampling setiap hari sampai kultur mencapai fase kematian. Penghitungan atau
analisis jumlah sel dilakukan dengan metode hitungan langsung menggunakan hemasitometer dan mikroskop Hadioetomo 1993. Kurva pertumbuhan
Chaetoceros gracilis ditentukan dengan melakukan penghitungan jumlah setiap
hari, selanjutnya dibuat kurva pertumbuhan.
3.3.2 Ekstraksi, uji aktivitas dan stabilitas senyawa antibakteri dari ekstrak Chaetoceros gracilis
Tahap 1 Ekstraksi senyawa antibakteri dari Chaetoceros gracilis Ekstraksi senyawa antibakteri dilakukan dengan menggunakan metanol.
Metode ekstraksi mengacu pada laporan Wang 1999, Naviner et al. 1999,dan Nugraheny 2000, yang dimodifikasi. Tahap ekstraksi dilakukan dengan metode
maserasi, yaitu sampel direndam dalam pelarut yang digunakan. Pada penelitian ini, metode maserasi dikombinasi dengan pengadukan stirring
menggunakan magnetic stirrer. Sebelum tahap maserasi, biomasa Chaetoceros gracilis
dipecah selnya dengan menggunakan glass beads dan vorteks Tujuan pemecahan sel ini antara lain agar komponen aktif yang ada di dalam sel mudah
keluar sehingga diperoleh lebih banyak. Tahap 2 Analisis aktivitas antibakteri dari ekstrak mikroalga Chaetoceros gracilis
pada bakteri uji Ekstrak dari Chaetoceros gracilis yang diperoleh diaplikasikan pada
beberapa jenis bakteri patogen Gram negatif Escherichia coli ATCC 25922 dan Vibrio harveyi
serta bakteri Gram positif Bacillus cereus ATCC 13091 dan Staphylococcus aureus
ATCC 25923 1 Persiapan media pertumbuhan bakteri uji
Media Mueller Hinton Broth MHB disiapkan untuk inokulasi bakteri, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 ml.
Media MHB diperlukan untuk menumbuhkan bakteri uji dalam media cair. Media yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri adalah Mueller Hinton Agar MHA
yang sebelumnya disiapkan dalam tabung reaksi sebanyak 20 ml. Kedua media ini disterilkan sebelum digunakan.
2 Pengujian senyawa antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi agar, dimana ekstrak diteteskan ke dalam paper disc, selanjutnya diletakkan ke dalam media
MHA beku yang telah mengandung bakteri. Kemudian diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37
o
C, selanjutnya diukur diameter hambatan yang terbentuk. Adanya zona bening menunjukkan adanya hambatan terhadap pertumbuhan
bakteri yang diuji. Tahap 3 Analisis potensi daya hambat relatif antibakteri terhadap berbagai
antibiotik komersial Potensi antibakteri dilakukan dengan membandingkan diameter
hambatan yang terbentuk di sekitar paper disc yang telah diberi ekstrak dengan paper disc
lain yang mengandung antibiotik sintetis komersial kloramfenikol, tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan ampisilin dengan konsentrasi sama. Masing-
masing uji dilakukan 2 kali ulangan, masing-masing duplo. Potensi dapat diukur dengan rumus:
Diameter hambatan ekstrak Potensi daya hambat =
x100 Diameter hambatan antibiotik
Tahap 4 Analisis stabilitas senyawa antibakteri dari ekstrak Chaetoceros gracilis Stabilitas ekstrak dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari
ekstrak C. gracilis yang disimpan sampai 6 bulan pada suhu -18 – -20
o
C. Ekstrak C. gracilis disimpan selama 1,2 3, dan 6 bulan. Ekstrak diuji aktivitas
antibakterinya menggunakan metode difusi agar, seperti pada uji aktivitas antibakteri.
3.3.3 Analisis pengaruh ekstrak Chaetoceros gracilis terhadap kerusakan bakteri
Kerusakan bakteri oleh ekstrak Chaetoceros gracilis dilakukan dengan cara mengkontakkan bakteri dengan ekstrak Chaetoceros gracilis. Selanjutnya
dianalisis kebocoran sel bakteri, kerusakan dinding sel bakteri, dan kerusakan morfologi sel bakteri.
Tahap 1 Analisis kebocoran sel bakteri Bunduki et al. 1995 Pengamatan kebocoran sel dilakukan untuk mempelajari bagaimana
ekstrak mengganggu permeabilitas membran sel. Mekanisme perusakan membran sel merupakan salah satu tanda tidak normalnya sel setelah ada
perlakuan ekstrak. Analisis kebocoran sel dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm. Panjang
gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur protein sel yang bocor, sedangkan panjang gelombang 260 nm untuk mengukur kadar asam nukleat
yang bocor. Tahap 2 Analisis N-asetil-glukosamin Reissig yang diacu oleh Bintang 1993
Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk menentukan pengaruh antibakteri terhadap dinding sel bakteri dengan cara mengukur kadar N-asetil-
glukosamin sebagai prazat mukopeptida pembentuk dinding sel. Tahap 3 Analisis morfologi sel bakteri
Analisis morfologi sel dilakukan untuk mempelajari morfologi sel akibat penggunaan ekstrak antibakteri. Morfologi sel yang dikontakkan dengan ekstrak
maupun tidak dikontakkan dengan ekstrak diamati menggunakan Scanning Electron Microscopy
SEM.
3.3.4 Analisis kandungan senyawa kimia Chaetoceros gracilis
Tahap 1 Analisis kandungan protein, lemak dan karbohidrat Analisis kandungan protein, lemak dan karbohidrat dilakukan pada
biomasa Chaetoceros gracilis menggunakan metode Lowrey et al. 1951, Blight dan Dryer 1959, dan Kochert 1978 yang diacu dalam Chrismada 1993
Tahap 2 Analisis komposisi asam amino Analisis komposisi asam amino dilakukan pada biomasa Chaetoceros
gracilis dengan menggunakan High Performance Liquid Chromatography
Shimadzu Kondisi alat yang digunakan adalah sebagai berikut: Kolom
: Ultra techspere Laju aliran fase mobil : 1 mLmenit
Detektor : Fluoresensi
Fase mobil : Bufer A terdiri dari Na-asetat 0,025 M, Na-EDTA
0,05 , metanol 9 dan buffer B terdiri dari metanol 95
Tahap 3 Analisis komposisi lemak Analisis komposisi asam lemak dilakukan pada biomasa Chaetoceros
gracilis dengan menggunakan Gas Chromatography Shimadzu. Kondisi alat
yang digunakan adalah sebagai berikut: Kolom
: Cyanopropil methyl sil capillary column Laju alir N
2
: 20 mLmenit Laju alir H
2
: 30 mLmenit Laju alir udara
: 200 – 250 mLmenit
Suhu injektor : 220
o
C Suhu detector
: 240
o
C Suhu kolom
: 125
o
C Volume injek
: 1 µL Diameter kolom
: 0,25 mm Tahap 4 Analisis kandungan mineral
Analisis komposisi kandungan mineral dilakukan pada biomasa Chaetoceros gracilis
menggunakan Atomic Absorbtion Spectrophotometer Hitachi Z 5000.
Tahap 5 Analisis fitokimia dan asam nukleat Analisis fitokimia dan kandungan asam nukleat dilakukan pada biomasa
Chaetoceros gracilis. Fitokimia yang dianalisis meliputi uji alkaloid, steroid,
flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, ninhidrin, Molisch. Kandungan asam nukleat dianalisis menggunakan Gent Quant.
4 KULTIVASI Chaetoceros gracilis DALAM MEDIUM NPSi
4.1 Pendahuluan
