Sterilisasi Alat Pembuatan Agar Miring Pembuatan Stok Kultur Masing-masing sebanyak satu ose dari biakan murni bakteri Persiapan Inokulum Bakteri

3.7.1 Sterilisasi Alat

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antimikroba ini disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat – alat gelas disterilkan di dalam oven pada suhu 170 C selama 1 jam. Sebelum mulai pengerjaan meja dibersihkan dari debu dan dilap menggunakan cairan desinfektan, untuk daerah sekitar pengerjaan disemprot dengan etanol 70 dan dibiarkan selama 15 menit sebelum digunakan. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan lampu bunsen Lay dan Sugyo, 1992.

3.7.2 Pembuatan Agar Miring

Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 5 ml media nutrien agar, didiamkan pada suhu kamar sampai sediaan membeku pada posisi miring kira-kira 45 o C kemudian disimpan dalam lemari pendingin.

3.7.3 Pembuatan Stok Kultur Masing-masing sebanyak satu ose dari biakan murni bakteri

Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter diversus, digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan Nutrien Agar miring, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 + 2 o C. 3.7.4 Uji Identifikasi Bakteri 3.7.4.1 Pengecatan Gram Cara : Sediakan objek glass, dicuci dengan alkohol lalu difiksasi di atas api bunsen. Lalu teteskan satu tetes air suling pada objek glass, lalu ambil masing-masing satu ose biakan koloni bakteri Staphylococcus epidermidis, Universitas Sumatera Utara Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus dihomogenkan atau disuspensikan, ratakan dan keringkan dengan fiksasi. Kemudian tambahkan satu tetes gentian violet sampai menutupi seluruh sediaan. Didiamkan selama 1 menit dan dibilas dengan air suling. Lalu tambahkan satu tetes larutan iodium dan dibilas dengan air suling. Dibilas objek glass dengan aceton-alkohol hingga sediaan tidak berwarna, keringkan. Kemudian tetesi dengan larutan safranin, biarkan 30-60 detik, Dibilas larutan safranin dengan air suling sampai bersih dan dikeringkan. Tetesi dengan minyak imersi, dilihat dibawah mikroskop Hadioetomo, 1993. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 6 halaman 71-72

3.7.4.2 Pertumbuhan Bakteri pada Media Selektif

- Masing-masing sebanyak satu ose dari stok kultur Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan cawan petri yang berisi media Mac. Conkey, tutup cawan petri dan dibungkus. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 + 2 o C. - Masing-masing sebanyak satu ose dari stok kultur bakteri Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus aureus digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan cawan petri yang berisi media MSA, tutup cawan petri dan dibungkus. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35 + 2 o C - Sebanyak satu ose dari stok kultur bakteri Streptococcus viridans digoreskan dengan metode sinambung pada permukaan cawan petri yang berisi media blood agar, tutup cawan petri dan dibungkus. Diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35 + 2 o C. Universitas Sumatera Utara Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7 halaman 73-74 Cappuccino and Sherman, 1987.

3.7.4.3 Uji Biokimia A. Uji Karbohidrat Cappuccino and Sherman, 1987

Siapkan media cair Glukosa tabung I, Laktosa tabung II, Maltosa tabung III, Manitol tabung IV dan Sukrosa tabung V. Sediakan satu tabung sebagai kontrol. Pada masing-masing tabung diberi tabung Durham mulut tabung di bawah. Tutup semua mulut tabung reaksi dengan kapas dan disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Lalu amati. Hasilnya: karbohidrat + : Jika terjadi perubahan dari warna biru tua menjadi kuning karbohidrat - : Jika tidak terjadi perubahan warna Tetap biru tua Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 9 halaman 76-80.

B. Uji Katalase

Sebanyak satu ose dari stok kultur bakteri Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus aureus diletakkan pada objek gelas. Tambahkan 1 – 2 tetes H 2 2 3. Lalu amati. Hasilnya: Katalase + : adanya gelembung - gelembung udara ada aktivitas Katalase - : tidak adanya gelembung - gelembung udara Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 8 halaman 75. Universitas Sumatera Utara

C. UJI IMVIC Indol, Methyl red, Voges proskauer, Simon sitrat Cappuccino and Sherman, 1987

a Uji Indol Siapkan II tabung berisi media indol. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam Diteteskan 0,5 ml larutan kovaks kedalam tabung media yang telah diinkubasi. Biarkan 2-3 menit, lalu amati. Hasilnya: Indol + : Jika terbentuk cincin berwarna merah permukaannya Indol - : Jika terbentuk cincin berwarna kuning pada permukaannya Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 81. b Uji Methyl Red MR Siapkan II tabung berisi media MR - VP. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Diteteskan 0,5 ml methyl merah ke dalam tabung media yang telah diinkubasi. Kocok dan biarkan 2-3 menit, lal amati. Hasilnya: MR + : Jika Media berubah menjadi merah MR - : Jika Media tetap kuning Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 82 Universitas Sumatera Utara c Uji Voges Proskauer VP Siapkan II tabung berisi media MR - VP. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Diteteskan 0,6 ml reagen α-naphtol dan 0,2 ml larutan KOH 40 ke dalam tabung media yang telah diinkubasi. Kocok dan biarkan 2-3 menit, lalu amati. Hasilnya: VP + : Jika terbentuk cincin merah VP - : Jika tidak terbentuk cincin merah Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 83. d Uji Simon Citrat Siapkan II tabung berisi simon sitrat agar miring. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Diteteskan 0,6 ml reagen α-naphtol dan 0,2 ml larutan KOH 40 ke dalam tabung media yang telah diinkubasi. Kocok dan biarkan 2-3 menit, lalu amati. Hasilnya: Simon citrat + : Jika terjadi perubahan warna hijau menjadi biru Simon citrat - : Jika tetap warna hijau Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 10 halaman 83 Universitas Sumatera Utara

D. Uji Urease

Siapkan II tabung berisi media urease agar miring. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Lalu amati. Hasilnya: Urease + : Jika terjadi perubahan dari jernih menjadi merah rosa Urease - : Jika tidak terjadi perubahan warna Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 11 halaman 85

E. Triple Sugar Iron Agar TSIA

Siapkan II tabung berisi media TSIA agar miring. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Dengan cara menusukkan bakteri sampai mendekati dasar media Buttt, lalu ditarik dan digoreskan bakteri pada permukaan agar miring Slant. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Lalu amati. Hasilnya: Gas + : Jika bagian bawah tabung ada gelembung udara Gas - : Jika bagian bawah tabung tidak ada gelembung udara H 2 S + : Jika ada warna hitam pada dasar media H 2 S - : Jika tidak ada warna hitam pada dasar media Slant dan Butt: bersifat Alkali basa jika berwarna merah Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 12 halaman 86

F. Uji Semi solid Mortility

Universitas Sumatera Utara Siapkan II tabung berisi media mortility semid solid. Inokulasikan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus ke dalam tabung I dan II. Dengan cara menusukkan bakteri sampai mendekati dasar tidak sampai dasar dengan ose lurus. Diinkubasi pada suhu 35 + 2 o C selama 24 jam. Lalu amati. Hasilnya: Semi solid + : Bakteri bergerak bila ada pertumbuhan seperti akar Semi solid - : Bakteri tidak bergerak bila media jernih disepanjang garis tusukan. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 87.

3.7.5 Persiapan Inokulum Bakteri

Dari stok kultur bakteri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeroginosa dan Citrobacter diversus yang telah tumbuh diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml larutan NaCl 0,9 steril lalu inkubasi selama + 1 jam, kemudian dihomogenkan dengan vorteks hingga diperoleh kekeruhan suspensi bakteri yang sama dengan kekeruhan standart Mc. Farland, ini berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10 8 CFUml. Setelah itu dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml biakan bakteri 10 8 CFUml, dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi larutan NaCl 0,9 sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen, maka diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 10 6 CFUml. 3.8 Pembuatan Larutan Uji Fraksi n-Heksana, Etilasetat dan Etanol dari Daun Kecapi Sandoricum koetjape Merr. dengan Berbagai Konsentrasi