Lokasi dan Waktu Penelitian Metode Penelitian Pembuatan Fraksi n-Heksana, Etil Asetat dan Etanol Daun Kecapi Sandoricum koetjape Merr.

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2010 - Agustus 2010 di laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi penelitian meliputi penyiapan sampel, identifikasideterminasi sampel, pengolahan sampel, pembuatan ekstrak, uji aktivitas antimikroba fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi etanol dari daun tumbuhan kecapi Sandoricum koetjape.Merr terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus dengan metode difusi agar menggunakan punch hole Pencetak lubang, kemudian daya hambat zona jernih diukur dengan menggunakan jangka sorong. 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat-alat yang digunakan adalah: Neraca kasar Ohaus, Neraca listrik Mettler Toledo, rotary evaporator, freeze dryer, alat destilasi, alat-alat gelas, aluminium foil, eksikator Glaswerk Werthein, krus porselin, mikroskop Olympus, objek glass, deck glass, oven Fischer Scientific, blender National, Universitas Sumatera Utara autoklaf Webeco, cawan petri, inkubator Fischer Scientific, spatula, lemari pendingin Toshiba, jarum ose, pinset, hot plate Fisons, lampu bunsen, Mikro Pipet, Pipet serologi, Pipet Tetes, Bola Karet, Kertas Perkamen, Cawan Petri, Pencetak lubang Punch Hole, Jangka sorong.

3.3.2 Bahan –bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Kecapi Sandoricum koetjape.Merr, n-heksana, Etilasetat, Etanol 96, akuades, Nutrien Agar, Mueller Hinton Agar, larutan fisiologis NaCl 0,9 steril, etanol 70, larutan kristal violet, aceton, larutan safranin, larutan iodine, Media Mac. Conkey Oxoid, Maltosa Salt Agar, gluko sa, maltosa, laktosa, manitol, sukrosa, lndol, Methyl-red MR and Voges Prouskauer VP, Simmons Citrate Agar, Urease, Reagen Kovacks, Reagen MR dan VP, Triple Sugar Iron Agar TSI, bakteri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus. 3.4 Pembuatan Media dan Pereaksi 3.4.1 Nutrient Agar NA Oxoid, 2006 Komposisi: Lab-lemco powder 1,0 g Yeast extract 2,0 g Peptone 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Bacto- Agar 15,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 28 g NA kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut Universitas Sumatera Utara sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.2 Mueller Hinton Agar MHA Oxoid, 2006

Komposisi : Beef, dehydrated infusion from 300 g Casein hydrolysate 17,5 g Starch 1,50 g Bacto – Agar 17,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 38 g MHA kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.3 Blood Agar Oxoid, 2006

Komposisi : Spesial Peptone 23,0 g Starch 1,50 g Sodium chloride 5,0 g Agar 10,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 39 g serbuk blood agar kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Universitas Sumatera Utara Jika blood agar untuk segera dipakai, dinginkan media yang telah steril pada suhu 40-50 C dan ketika masih cair tambahkan 3 ml darah kambing diaduk terus untuk mencegah timbulnya gelembung udara, kemudian distribusikan kecawan petri. 3.4.4 Media Mac. Conkey Oxoid, 2006 Komposisi: Peptone 20,0 g Lactose 20,0 g Bile Salt 1,5 g Sodium chloride 5,0 g Agar 12,0 g Phenol red 0,075 g Cristal violet 0.001 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 52 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.5 Manitol Salt Agar Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Mannitol 5,5 g Sodium chloride 75,0 g Phenol red 0,025 g Agar 15,0 g Universitas Sumatera Utara Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 111 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.6 Larutan Gentian violet

Komposisi: Gentian violet 5 g Alkohol 96 hingga 100 ml Fenol 5 g Air suling hingga 100 ml Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 5 g gentian violet, kemudian dalam erlenmeyer bertutup dilarutkan bahan dengan alkohol 96 hingga 100 ml. Ditimbang 5 g fenol dan dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Untuk pemakaian dicampur 10 ml larutan gentian violet dan 90 ml larutan fenol, dikocok hingga homogen Hadioetomo, 1993.

3.4.7 Larutan Aceton-Alkohol

Komposisi: Alkohol 96 250 ml Aceton 250 ml Cara pembuatan: dicampurkan alkohol 96 dan aceton, dikocok hingga homogen Hadioetomo, 1993. Universitas Sumatera Utara

3.4.8 Larutan Safranin

Komposisi: Safranin 0,25 g Alkohol 96 10 ml Air suling hingga 100 ml Cara pembuatan: ditimbang 0,25 g safranin, kemudian dilarutkan dalam alkohol 96 lalu ditambahkan air suling hingga 100 ml Hadioetomo, 1993.

3.4.9 Larutan Iodine

Komposisi: Iodium 1 g Kalium iodida 2 g Air suling hingga 100 ml Cara pembuatan: ditimbang 2 g kalium iodida, kemudian dilarutkan dengan sebagian air suling. Ditimbang iodium sebanyak 1 g dan dilarutkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan kalium iodida, diaduk hingga larut sempurna kemudian diencerkan dengan sisa air suling hingga 100 ml. Larutan disimpan dalam wadah berwarna coklat Cappuccino and Sherman, 1987.

3.4.10 Larutan NaCl 0,9

Komposisi: Natrium Klorida 9 g Air suling steril hingga 1000 ml Cara pembuatan: Natrium klorida ditimbang sebanyak 9 g lalu dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit dalam labu takar 1000 ml sampai media larut sempurna Ditambahkan air suling steril sampai garis tanda, dimasukkan Universitas Sumatera Utara dalam erlenmeyer steril yang bertutup lalu disterilkan pada autoklaf suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit Depkes RI, 1979.

3.4.11 Media Cair Glukosa Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Glucose 5,5 g pH = 6,9 ± 0,2 Cara pembuatan: Ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.12 Media Cair Laktosa Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Lactose 5,5 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu Universitas Sumatera Utara mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.13 Media Cair Maltosa Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Maltose 5,5 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.14 Media Cair Manitol Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Mannitol 5,5 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 17 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit Universitas Sumatera Utara

3.4.15 Media Cair Sukrosa Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g Peptone 5,0 g Sukrose 5,5 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.16 Media lndol Oxoid, 2006

Komposisi: Sodium chloride cristal 5,0 g Peptone 10,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 15 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.17 Media Methyl-red MR and Voges Prouskauer VP Oxoid, 2006

Komposisi: Peptone 7,0 g Glukose 5,0 g Phosphate buffer 5,0 g Universitas Sumatera Utara Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 17 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

3.4.18 Simmons Citrate Agar Oxoid, 2006

Komposisi: Magnesium sulphate 0,2 g Ammonium dihydrogen phosphate 0,2 g Sodium ammonium phosphate 0,8 g Sodium citrate, tribasic 2,0 g Sodium chloride 5,0 g Cristal violet 0,08 g Agar 15,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 23 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku. 3.4.19 Reagen test IMVIC Indol, Methyl red, Voges proskauer, Simon sitrat 3.4.19.1 Reagen Kovacks Oxoid, 2006 Komposisi: P.Dimethyl amino benzaldehid 2 g Universitas Sumatera Utara Amyl alkohol 75 ml HCl pekat 25 ml Cara pembuatan: didalam botol P.Dimethyl amino benzaldehid dilarutkan dalam Amy alkohol. Bila tidak larut panaskan di water bath lalu dinginkan, setelah dingin tambahkan HCl pekat perlahan – lahan melalui dinding botol.

3.4.19.2 Reagen Methyl red Oxoid, 2006

Komposisi: Methyl red 0,02 g Etanol 95 60 ml Cara pembuatan: Methyl red dilarutkan dalam etanol 95 , setelah larut cukupkan volume air suling sampai 100 ml.

3.4.19.3 Reagen Voges Proskauer Oxoid, 2006

Komposisi terdiri dari 2 larutan:

1. Larutan Naphtol 5

Komposisi: Alpha Naphtol 5 g Etanol 95 ad 100 ml Cara pembuatan: Alpha Naphtol dilarutkan dalam etanol 95 , kocok hingga larut sempurna.

2. Larutan KOH 40

Komposisi: KOH 40 g Universitas Sumatera Utara Air suling ad 100 ml Cara pembuatan: KOH dilarutkan dalam 100 ml air suling, kocok hingga larut sempurna.

3.4.20 Urease Oxoid, 2006

Komposisi: Peptone 1,0 g Dextrose 1,0 g Sodium chloride 5,0 g Disodium phosphate 1,2 g Potassium dihydrogen phosphate 0,8 g Phenol red 0,08 g Agar 15,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 24 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku.

3.4.21 Triple Sugar Iron Agar TSIA Oxoid, 2006

Komposisi: Lab-lemco powder 3,0 g Yeast extract 3,0 g Peptone 20,0 g Sodium chloride 5,0 g Universitas Sumatera Utara Lactose 10,0 g Sukrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ferric citrate 1,0 g Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 12,00 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 65 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku.

3.4.22 Suspensi standar Mc.Farland

Suspensi standar yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri sama dengan 10 8 CFUml. Komposisi: Larutan asam sulfat 1 99,5 ml Larutan barium klorida 1,175 bv 0,5 ml Cara pembuatan: Kedua larutan dicampurkan dalam tabung reaksi steril, dikocok sampai homogen dan ditutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri sama dengan kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi bakteri 10 8 CFUml Vandepitte, 1991. Universitas Sumatera Utara

3.5 Penyiapan Sampel

Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, identifikasi sampel dan pengolahan sampel.

3.5.1 Pengambilan sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang digunakan adalah daun tumbuhan kecapi Sandoricum koetjape.Merr yang diperoleh dari daerah jln. Pangkalan Brandan Dusun II Desa Beras Basah, Gang Nusantara Kecamatan Pangkalan Susu Kabupaten Langkat. Gambar Morfologi sampel Tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 64

3.5.2 Identifikasi Sampel

Identifikasi sampel dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan. Hasil identifikasi sampel dapat dilihat pada lampiran I halaman 63

3.5.3 Pengolahan Sampel Sampel yang digunakan adalah daun kecapi Sandoricum koetjape Merr.

yang masih segar, dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan lalu ditimbang berat basahnya yaitu 12,7 Kg, dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40 – 50 o C hingga kering. Daun telah dianggap kering jika daun diremas menjadi hancur, Setelah kering sampel ditimbang sebagai berat kering yaitu 5 Kg, selanjutnya diserbukkan dengan menggunakan blender, diayak lalu ditimbang beratnya yaitu 4,7 Kg. Serbuk simplisia disimpan dalam wadah.

3.6 Pembuatan Fraksi n-Heksana, Etil Asetat dan Etanol Daun Kecapi Sandoricum koetjape Merr.

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 1200 g serbuk simplisia daun kecapi dimaserasi dengan 4 liter n-heksana dalam wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sering diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut n-heksana dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari kemudian dituang melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental, kemudian fraksi di freeze dryer dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi n-heksana daun kecapi 24,5 g. Kemudian ampasnya dimaserasi kembali dengan 4 liter etilasetat dalam wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sering diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut etilasetat dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari kemudian dituang melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental, kemudian fraksi di freeze dryer dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi etilaetat daun kecapi 38,6 g. Kemudian ampasnya dimaserasi kembali dengan 4 liter etanol 96 dalam wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sering diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut etanol 96 dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari kemudian dituang melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental, kemudian ekstrak di freeze dryer + - 40 o C dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi etanol daun kecapi 38,5 g.

3.7 Uji Aktivitas Antibakteri