BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2010 - Agustus 2010 di laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan
laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi penelitian meliputi penyiapan sampel, identifikasideterminasi sampel, pengolahan sampel,
pembuatan ekstrak, uji aktivitas antimikroba fraksi n-heksana, fraksi etilasetat dan fraksi etanol dari daun tumbuhan kecapi Sandoricum koetjape.Merr terhadap
bakteri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa dan Citrobacter diversus dengan metode difusi agar menggunakan
punch hole Pencetak lubang, kemudian daya hambat zona jernih diukur dengan menggunakan jangka sorong.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah: Neraca kasar Ohaus, Neraca listrik Mettler Toledo, rotary evaporator, freeze dryer, alat destilasi, alat-alat gelas,
aluminium foil, eksikator Glaswerk Werthein, krus porselin, mikroskop Olympus, objek glass, deck glass, oven Fischer Scientific, blender National,
Universitas Sumatera Utara
autoklaf Webeco, cawan petri, inkubator Fischer Scientific, spatula, lemari pendingin Toshiba, jarum ose, pinset, hot plate Fisons, lampu bunsen, Mikro
Pipet, Pipet serologi, Pipet Tetes, Bola Karet, Kertas Perkamen, Cawan Petri, Pencetak lubang Punch Hole, Jangka sorong.
3.3.2 Bahan –bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Kecapi Sandoricum koetjape.Merr, n-heksana, Etilasetat, Etanol 96, akuades, Nutrien
Agar, Mueller Hinton Agar, larutan fisiologis NaCl 0,9 steril, etanol 70, larutan kristal violet, aceton, larutan safranin, larutan iodine, Media Mac. Conkey
Oxoid, Maltosa Salt Agar, gluko sa, maltosa, laktosa, manitol, sukrosa, lndol, Methyl-red MR and Voges Prouskauer VP, Simmons Citrate Agar, Urease,
Reagen Kovacks, Reagen MR dan VP, Triple Sugar Iron Agar TSI, bakteri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, Pseudomonas aeruginosa
dan Citrobacter diversus.
3.4 Pembuatan Media dan Pereaksi 3.4.1 Nutrient Agar NA Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-lemco powder
1,0 g Yeast extract
2,0 g Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g Bacto- Agar
15,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 28 g NA kemudian disuspensikan
dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut
Universitas Sumatera Utara
sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.2 Mueller Hinton Agar MHA Oxoid, 2006
Komposisi : Beef, dehydrated infusion from 300 g
Casein hydrolysate 17,5 g
Starch 1,50 g
Bacto – Agar 17,0 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 38 g MHA kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil.
Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.3 Blood Agar Oxoid, 2006
Komposisi : Spesial Peptone 23,0 g
Starch 1,50 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 10,0 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 39 g serbuk blood agar kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi
sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi
aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
Universitas Sumatera Utara
Jika blood agar untuk segera dipakai, dinginkan media yang telah steril pada suhu 40-50
C dan ketika masih cair tambahkan 3 ml darah kambing diaduk terus untuk mencegah timbulnya gelembung udara, kemudian distribusikan
kecawan petri. 3.4.4 Media Mac. Conkey Oxoid, 2006
Komposisi: Peptone
20,0 g Lactose
20,0 g Bile Salt
1,5 g Sodium chloride
5,0 g Agar
12,0 g Phenol red
0,075 g Cristal violet 0.001 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 52 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil.
Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.5 Manitol Salt Agar Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Mannitol 5,5 g
Sodium chloride 75,0 g
Phenol red 0,025 g Agar
15,0 g
Universitas Sumatera Utara
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 111 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi
sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi
aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.6 Larutan Gentian violet
Komposisi: Gentian violet
5 g Alkohol 96 hingga 100 ml
Fenol 5 g
Air suling hingga 100 ml
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 5 g gentian violet, kemudian dalam erlenmeyer bertutup dilarutkan bahan dengan alkohol 96 hingga 100 ml.
Ditimbang 5 g fenol dan dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Untuk pemakaian dicampur 10 ml larutan gentian violet dan 90 ml larutan fenol, dikocok
hingga homogen Hadioetomo, 1993.
3.4.7 Larutan Aceton-Alkohol
Komposisi: Alkohol 96
250 ml Aceton
250 ml Cara pembuatan: dicampurkan alkohol 96 dan aceton, dikocok hingga
homogen Hadioetomo, 1993.
Universitas Sumatera Utara
3.4.8 Larutan Safranin
Komposisi: Safranin
0,25 g Alkohol 96
10 ml Air suling hingga
100 ml Cara pembuatan: ditimbang 0,25 g safranin, kemudian dilarutkan dalam
alkohol 96 lalu ditambahkan air suling hingga 100 ml Hadioetomo, 1993.
3.4.9 Larutan Iodine
Komposisi: Iodium
1 g Kalium iodida
2 g Air suling hingga
100 ml Cara pembuatan: ditimbang 2 g kalium iodida, kemudian dilarutkan
dengan sebagian air suling. Ditimbang iodium sebanyak 1 g dan dilarutkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan kalium iodida, diaduk hingga larut sempurna
kemudian diencerkan dengan sisa air suling hingga 100 ml. Larutan disimpan dalam wadah berwarna coklat Cappuccino and Sherman, 1987.
3.4.10 Larutan NaCl 0,9
Komposisi: Natrium Klorida 9 g
Air suling steril hingga 1000 ml Cara pembuatan: Natrium klorida ditimbang sebanyak 9 g lalu dilarutkan
dalam air suling steril sedikit demi sedikit dalam labu takar 1000 ml sampai media larut sempurna Ditambahkan air suling steril sampai garis tanda, dimasukkan
Universitas Sumatera Utara
dalam erlenmeyer steril yang bertutup lalu disterilkan pada autoklaf suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Depkes RI, 1979.
3.4.11 Media Cair Glukosa Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Glucose 5,5 g
pH = 6,9 ± 0,2
Cara pembuatan: Ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam
erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna.
Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf
pada suhu 121
o
C selama tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.12 Media Cair Laktosa Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Lactose 5,5 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu
Universitas Sumatera Utara
mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.13 Media Cair Maltosa Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Maltose 5,5 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu
mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.14 Media Cair Manitol Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Mannitol 5,5 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 17 g bahan, kemudian disuspensikan
dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut
sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit
Universitas Sumatera Utara
3.4.15 Media Cair Sukrosa Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-Lemco powder 3,0 g
Peptone 5,0 g
Sukrose 5,5 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 13 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan media kedalam tabung reaksi sebanyak 15 ml, lalu
mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.16 Media lndol Oxoid, 2006
Komposisi: Sodium chloride cristal 5,0 g
Peptone 10,0 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 15 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat
dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.17 Media Methyl-red MR and Voges Prouskauer VP Oxoid, 2006
Komposisi: Peptone
7,0 g Glukose
5,0 g Phosphate buffer
5,0 g
Universitas Sumatera Utara
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 17 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat
dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.18 Simmons Citrate Agar Oxoid, 2006
Komposisi: Magnesium sulphate
0,2 g Ammonium dihydrogen phosphate 0,2 g
Sodium ammonium phosphate 0,8 g
Sodium citrate, tribasic 2,0 g
Sodium chloride 5,0 g Cristal violet 0,08 g
Agar 15,0 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 23 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat
dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku.
3.4.19 Reagen test IMVIC Indol, Methyl red, Voges proskauer, Simon sitrat 3.4.19.1 Reagen Kovacks Oxoid, 2006
Komposisi: P.Dimethyl amino benzaldehid 2 g
Universitas Sumatera Utara
Amyl alkohol 75 ml
HCl pekat 25 ml
Cara pembuatan: didalam botol P.Dimethyl amino benzaldehid dilarutkan dalam Amy alkohol. Bila tidak larut panaskan di water bath
lalu dinginkan, setelah dingin tambahkan HCl pekat perlahan – lahan melalui dinding botol.
3.4.19.2 Reagen Methyl red Oxoid, 2006
Komposisi: Methyl red 0,02 g Etanol 95 60 ml
Cara pembuatan: Methyl red dilarutkan dalam etanol 95 , setelah larut cukupkan
volume air suling sampai 100 ml.
3.4.19.3 Reagen Voges Proskauer Oxoid, 2006
Komposisi terdiri dari 2 larutan:
1. Larutan Naphtol 5
Komposisi: Alpha Naphtol 5 g
Etanol 95 ad 100 ml Cara pembuatan:
Alpha Naphtol dilarutkan dalam etanol 95 , kocok hingga larut sempurna.
2. Larutan KOH 40
Komposisi: KOH 40 g
Universitas Sumatera Utara
Air suling ad 100 ml
Cara pembuatan: KOH dilarutkan dalam 100 ml air suling, kocok
hingga larut sempurna.
3.4.20 Urease Oxoid, 2006
Komposisi: Peptone 1,0 g
Dextrose 1,0 g
Sodium chloride 5,0 g Disodium phosphate 1,2 g
Potassium dihydrogen phosphate 0,8 g
Phenol red 0,08 g Agar
15,0 g Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 24 g bahan, kemudian disuspensikan
dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut
sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu
121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku.
3.4.21 Triple Sugar Iron Agar TSIA Oxoid, 2006
Komposisi: Lab-lemco powder
3,0 g Yeast extract
3,0 g Peptone 20,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Universitas Sumatera Utara
Lactose 10,0 g Sukrose 10,0 g
Glucose 1,0 g Ferric citrate 1,0 g
Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red 0,024 g
Agar 12,00 g
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 65 g bahan, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai media larut sempurna. Lalu masukkan kedalam tabung reaksi 10 ml mulut tabung disumbat
dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian keluarkan tabung reaksi dari autoklaf letakkan pada posisi miring dan biarkan hingga membeku.
3.4.22 Suspensi standar Mc.Farland
Suspensi standar yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri sama dengan 10
8
CFUml. Komposisi: Larutan asam sulfat 1
99,5 ml Larutan barium klorida 1,175 bv
0,5 ml Cara pembuatan:
Kedua larutan dicampurkan dalam tabung reaksi steril, dikocok sampai homogen dan ditutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri sama dengan
kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi bakteri 10
8
CFUml Vandepitte, 1991.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Penyiapan Sampel
Penyiapan sampel meliputi pengambilan sampel, identifikasi sampel dan pengolahan sampel.
3.5.1 Pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang
digunakan adalah daun tumbuhan kecapi Sandoricum koetjape.Merr yang diperoleh dari daerah jln. Pangkalan Brandan Dusun II Desa Beras Basah, Gang
Nusantara Kecamatan Pangkalan Susu Kabupaten Langkat. Gambar Morfologi sampel Tumbuhan dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 64
3.5.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan.
Hasil identifikasi sampel dapat dilihat pada lampiran I halaman 63
3.5.3 Pengolahan Sampel Sampel yang digunakan adalah daun kecapi Sandoricum koetjape Merr.
yang masih segar, dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan lalu ditimbang berat basahnya yaitu 12,7 Kg, dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40 –
50
o
C hingga kering. Daun telah dianggap kering jika daun diremas menjadi hancur, Setelah kering sampel ditimbang sebagai berat kering yaitu 5 Kg,
selanjutnya diserbukkan dengan menggunakan blender, diayak lalu ditimbang beratnya yaitu 4,7 Kg. Serbuk simplisia disimpan dalam wadah.
3.6 Pembuatan Fraksi n-Heksana, Etil Asetat dan Etanol Daun Kecapi Sandoricum koetjape Merr.
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 1200 g serbuk simplisia daun kecapi dimaserasi dengan 4 liter n-heksana dalam wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari
cahaya dan sering diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut n-heksana dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari
kemudian dituang melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental,
kemudian fraksi di freeze dryer dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi n-heksana daun kecapi 24,5 g.
Kemudian ampasnya dimaserasi kembali dengan 4 liter etilasetat dalam wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sering
diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut etilasetat dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari kemudian dituang
melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental, kemudian fraksi di
freeze dryer dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi etilaetat daun kecapi 38,6 g. Kemudian ampasnya dimaserasi kembali dengan 4 liter etanol 96 dalam
wadah tertutup rapat, rendam selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sering diaduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi kembali dengan 3 liter pelarut
etanol 96 dan filtrat yang diperoleh dienapkan selama 2 hari kemudian dituang melalui penyaring. Semua maserat digabung menjadi satu lalu dipekatkan dengan
bantuan alat rotari evaporator sampai diperoleh fraksi kental, kemudian ekstrak di freeze dryer + - 40
o
C dan ditimbang. Diperoleh berat fraksi etanol daun kecapi 38,5 g.
3.7 Uji Aktivitas Antibakteri