sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau
biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Harborne, 1987.
3.9 Pembuatan ekstrak n-heksana, etilasetat dan etanol rumput laut secara
perkolasi berkesinambungan
Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi berkesinambungan menggunakan tiga pelarut. Cara kerja: sebanyak 400 g serbuk simplisia
dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi cairan penyari n-heksana sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya selama 3
jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, dituangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes
dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit,
ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat
yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa, kemudian ampasnya di keringkan dan diperkolasi kembali dengan menggunakan cairan penyari etilasetat
dengan prosedur perkolasi yang sama. Setelah perkolat etilasetat di peroleh, ampasnya di perkolasi kembali dengan menggunakan cairan penyari etanol
dengan menggunakan prosedur perkolasi yang sama. Masing-masing perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator dan dikering
bekukan dengan freeze dryer Depkes, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.10 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan didalam oven pada
suhu 170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Lay,1994.
3.11 Pembuatan Media 3.11.1 Media
Nutrient Agar NA
Komposisi : Bacto Beef extract 3 g Bacto peptone
5 g Bacto Agar
15 g Cara Pembuatan:
Sebanyak 23 g sediaan NA ditimbang, disuspensikan kedalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Kemudian media dimasukkan
kedalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid , 2013.
3.11.2 Media Mueller Hinton Agar MHA
Komposisi: Beef infusion form 300 g Casein hydrolysate 17,5 g
Starch 1,5 g
Agar 17 g
Cara pembuatan: Sebanyak 38 gram sediaan MHA ditimbang kemudian disuspensikan
dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai
terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi kain kasah.
Universitas Sumatera Utara
Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Oxoid , 2013.
3.11.3 Nutrient Broth
Komposisi: Bacto beef extract 3,0 g
Bacto peptone 5,0 g
Cara pembuatan: Sebanyak 8 g nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril sebanyak
1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Lalu disterilkan di autoklaf
121 C selama 15 menit Oxoid , 2013.
3.11.4 Pembuatan Agar Miring
Kedalam tabung reaksi dimasukkan 10 ml media Nutrien agar yang sudah dicairkan, kemudian diletakkan dengan posisi miring dengan kemiringan lebih
kurang 45
o
C, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas dan dibiarkan memadat.
3.12 Pembuatan Stok Kultur 3.12.1 Bakteri
Propionibacterium acne Biakan bakteri Propionibacterium acne dari strain utama diambil dengan
jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3.12.2 Bakteri Staphylococcus epidermidis
Biakan bakteri Staphylococcus epidermidis dari strain utama diambil
dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
Universitas Sumatera Utara
3.13 Penyiapan Inokulum 3.13.1 Bakteri
Propionibacterium acne
Koloni bakteri Propionibacterium acne diambil dari stok kultur diambil menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media
nutrient broth steril lalu diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama ± 3 jam sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer
UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995.
3.13.2 Bakteri Staphylococcus epidermidis
Koloni bakteri Staphylococcus epidermidis diambil dari stok kultur diambil
menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril lalu diinkubasikan pada 37
o
C selama ± 3 jam sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV
panjang gelombang 580 nm Ditjen POM, 1995.
3.14 Pembuatan larutan uji ekstrak n-heksana, etilasetat dan etanol dengan
berbagai konsentrasi.
Sebanyak 5 g masing-masing ekstrak n-heksana, ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 10 ml
dimetil sulfoksida DMSO dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml. Tambahkan dimetil sulfoksida DMSO hingga garis tanda dan diperoleh
konsentrasi ekstrak 500 mgml. Selanjutnya larutan tersebut diencerkan kembali dengan dimetil sulfoksida DMSO hingga didapat ekstrak dimetil sulfoksida
DMSO dengan konsentrasi 500 mgml, 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml, 90 mgml, 80 mgml, 70 mgml, 60 mgml,50 mgml, 40 mgml, 30
mgml.
Universitas Sumatera Utara
3.15 Metode Pengujian Efek Antibakteri secara In vitro
