MMP-9 terkuat ke bagian pembesaran yang lebih lemah. Pemeriksaan imunohistokimia MMP-9 dikerjakan di laboratorium Bagian Patologi
Anatomi FK Universitas Udayana. Interpretasi ekspresi MMP-9 dilakukan oleh peneliti dan 2 orang dosen pembimbing tanpa mengetahui data kliniko-
patologi pasien. Sel yang mengekspresikan MMP-9 akan tampak berwarna coklat pada
sitoplasma sel epitel ganas maupun stroma. Penilaian ekspresi MMP-9 dibuat berdasarkan analisis persentase sel tumor yang positif dan intensitas
pewarnaan Meng et al, 2012. Berdasarkan persentase sel ganas yang menunjukkan overekspresi MMP-9 maka dibagi menjadi 3 skor 0-3 yaitu 0
tidak terwarnai, 1+ 25 sel dari seluruh sel tumor, 2+ 25-75 sel dari seluruh sel tumor dan 3+ 75 sel dari seluruh sel tumor. Berdasarkan
intensitas warna coklat sel-sel ganas yang menunjukkan overekspresi MMP-9 maka dibagi menjadi 3 skala 0-3 yaitu: 0 negatif, 1 lemah, 2 sedang dan
3 kuat. Skor persentase dari sel tumor yang immunoreaktif kemudian dikalikan dengan skor intensitasnya.
4.7 Prosedur Penelitian
1. Peneliti mencari sediaan pasien KTP klasik dan KTPVF dari bahan operasi hemotiroidektomi, tiroidektomi total, dan Radical Neck Dissection RND
yang melakukan pemeriksaan histopatologi dari tahun 2011 sampai pertengahan tahun 2014 di RSUP Sanglah Denpasar.
2. Preparat hasil pulasan HE sesuai nomor-nomor diatas dikumpulkan, dievaluasi ulang dan dilakukan diagnosis ulang, supaya memenuhi kriteria
inklusi dan eksklusi sehingga didapat dua kelompok data yaitu KTP klasik dan KTPVF.
3. Apabila dalam proses penilaian ternyata ada slide yang tidak dapat dinilai, misalnya karena warna mulai kabur dilakukan proses pewarnaan kembali.
Apabila slide berjamur atau rusak maka dilakukan pemotongan ulang blok parafin.
4. Peneliti menentukan slide mana yang akan dipakai untuk pemeriksaan imuno-histokimia IHK
5. Peneliti mencari blok parafin sesuai preparat yang dipilih dan memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
6. Blok parafin dipotong setebal 4 mikrometer dengan mikrotom untuk pulasan IHK MMP-9.
7. Prosedur pulasan Hematoksilin-Eosin yang rutin dikerjakan di BagianSMF Patologi Anatomi FK UnudRSUP Sanglah Denpasar :
a. Dipotong blok parafin mengunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalan 4
μm, kemudian ditempelkan pada gelas obyek merk Sail Brand dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.
b. Deparafinisasi dengan dicelupkan pada xilol sebanyak 4 kali masing- masing celupan selama 5 menit.
c. Dehidrasi dengan akohol bertingkat dengan konsentrasi menurun mengunakan alkohol 95, alkohol 80, alkohol 75, dan alkohol
50 masing-masing celupan selama 2 menit. d. Dimasukkan ke air selama 10 menit.
e. Dic elupkan ke cat utama yaitu Harris’s hematoksilin selama 10 menit.
f. Dicuci dengan air selama 10 menit. g. Dilihat dibawah mikroskop, inti sel akan terlihat biru terang sedangkan
sitoplasma tidak berwarna. h. Dicelupkan pada cat pembanding eosin 1 selama 0,5-1 menit.
i. Didehidrasi dengan alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat mengunakan alkohol 70, alkohol 80, alkohol 95 dan alkohol
absolute, masing-masing celupan selama 2 menit. j. Dijernihan dengan xilol sebanyak 4 kali celupan, lama masing-masing
celupan selama 5 menit. k. Ditutup dengan cover glass.
8. Prosedur Pulasan IHK MMP-9 menggunakan antibodi monoklonal MMP-9
Abcam:
a. Dipotong blok parafin menggunakan mikrotom Leica 2125 RM dengan ketebalam 3 μm, kemudian direkatkan pada gelas obyek yang
telah dilapisi dengan poly-L-lysine, merk Sigma, dengan ukuran lebar 1 inchi, panjang 3 inchi dan tebal 1,2 mm.
b. Diinkubasi dalam incubator dengan suhu 37
o
C selama 1 malam. c. Dideparafinisasi dengan xylol, preparat dicelupkan ke dalam xylol
sebanyak 3 kali, masing-masing celupan selama 3 menit. d. Direhidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolut 2
kali, alkohol 95, alkohol 80, dan alkohol 70, masing-masing selama 3 menit.
e. Dicuci dengan aquadest selama 10 menit. f. Diteteskan H
2
O
2
dalam metanol 3 sampai menutupi seluruh permukaan jaringan selama 15 menit.
g. Dicuci dengan aquadest selama 10 menit. h. Dicuci dengan PBS phosphate buffer saline sebanyak 2 kali, masing-
masing selama 10 menit. i. Direndam dengan buffer sitrat 0,01 M, pH 6,0. Kemudian panaskan di
dalam oven microwave selama 15 menit, mula-mula dengan pemanasan tinggi 80
o
C sampai tepat mendidih kemudian dengan pemanasan sedang 50
o
C selama 5 menit. j. Dinginkan pada suhu kamar.
k. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
l. Teteskan 4 0 μl antibodi primer menggunakan antibody monoclonal
MMP-9 dari Abcam yang telah diencerkan pengenceran 1:100 selama 30 menit pada suhu kamar atau semalam pada suhu 4
C. m. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
n. Diteteskan Biotinylated Anti Polyvalent selama 10 menit. o. Dicuci dengan BS sebanyak 2 kali, masing-masing 10 menit.
p. Diteteskan Streptavidin Peroxidase selama 10 menit. q. Dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-masing selama 10 menit.
r. Diteteskan dengan reagen DAB selama 10 menit. s. Dicuci dengan air mengalir.
t. Dipulas dengan Mayer Hematoksilin selama 2 menit. u. Dicuci dengan air mengalir.
v. Didehidrasi dengan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol 70, alkohol 80, alkohol 95, dan alkohol absolut 2 kali, masing-masing
selama 3 menit. w. Dicelupkan ke dalam xylol sebanyak 3 kali, masing-masing selama 3
menit. x. Ditutup dengan cover glass.
9. Dibuatkan pula pengecatan IHK untuk kontrol positif dan negatif. 10. Pemeriksaan immunohistokimia MMP-9 dikerjakan di laboratorium IHK
bagian Patologi Anatomi FK Udayana RSUP Sanglah Denpasar.
11. Pencatatan dan pengumpulan data. 12. Analisis data
4.8 Skema Alur Penelitian
