3
METODE PENELITIAN A.
BahandanAlat
a.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Spektrofotometer UVVis StarDust
, kuvet, kandang tikus, tempat makan dan minum tikus, timbangan hewan, sentrifugator, tabung sentrifuge, neraca elektrik, mikropipet, ependorf, vortex, spuit
injeksi, jarum oral, dan alat gelas. b.
Bahan
Ekstrak etanol daun murbei Morus alba L., simvastatin, hewan uji yang digunakan tikus putih galur Wistar umur 2-3 bulan, dengan berat 150-250 gram, reagen
untuk mengukur kadar kolesterol yaitu Reagen Kit Kolesterol dengan metode CHOD- PAP, penyari yang digunakan adalah etanol 90, PTU untuk menginduksi kadar
kolesterol darah, pakan diet tinggi lemak, dan makanan serta minuman hewan uji pakan standar dan aquadest.
B. Jalannya Penelitian
a. Pembuatan simplisiaMohammadi Naik., 2008
Cara pembuatan simplisia daun murbei dicuci bersih dengan air, dikeringkan dengan cara diangin-anginkankurang lebih selama 5 hari.
b. Pembuatan ekstrak etanol daun murbei
Simplisia daun murbei kering diambil 1 Kg dimaserasi dengan 7 L etanol 90 sampai terendam sempurna pada suhu kamar selama 3 hari. Filtrat yang didapatkan
kemudian diuapkan sampai kering menggunakan evaporator. c.
Pengambilan sampling Sebelum dilakukan pengukuran kolesterol total, tikus dipuasakan terlebih dahulu
selama 16-18 jam. Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan dalam 3 tahap yaitu sebelum diberikan perlakuan, minggu pertama dan minggu kedua setelah induksi
menggunakan PTU serta pakan tinggi lemak. d.
Pembuatan Pakan Tinggi Lemak dan PTU a
Penentuan dosis Propiltiourasil Propiltiourasil PTU 100mg dilarutkan dalam 8 ml aquadest, sehingga tiap
ml larutan mengandung 12,5 mg PTU. Tiap tikus mendapatkan 12,5 mg PTU dalam sehari dan dibagi menjadi dua kali dosis pemberian selama 14 hari Allo et
al , 2013.
4
b Komposisi makanan untuk meningkatkan kadar kolesterol darah hewan uji
Tabel 1. Komposisi Pakan Tinggi Lemak No Nama bahan
Jumlah
1. Lemak kambing
1 Kg 2.
Kuning telur puyuh 20 butir 3.
Kuning telur bebek 2 butir 4.
Minyak goreng bekas
100 mL 5.
Mentega 250
e. Induksi hiperlipidemia dengan PTU dan pakan tinggi lemak
Induksi PTU dilakukan pada setiap kelompok kecuali kontrol normal dengan dosis 12,5 mgharisecara peroral, selain itu semua kelompok kecuali kelompok normal
juga diberikan pakan tinggi lemak selama dua minggu. f.
Perlakuan pada hewan uji a
Tikus putih jantan galur Wistar yang dibagi 5 kelompok secara acak, masing-masing kelompok diberi pakan tinggi lemak dan aquadest kecuali kontrol normal diberi pakan
standar. Kelompok I sebagai kontrol normal, kelompok II sebagai kontrol negatif diberi PTU, kelompok III diberi PTU dan simvastatin 0,72 mghari200 gram BB,
kelompok IV diberi PTU dan ekstrak etanol daun murbei 400mgKgBB secara per oral, kelompok V diberi PTU dan kombinasi ekstrak etanol daun murbei dosis
400mgKgBB dengan simvastatin 0,72 mghari200 gram BB. b
Pemberian perlakuan dilakukan setelah tikus diinduksi PTU dan diberi diet tinggi lemak, kemudian diobservasi dengan mengukur kadar kolesterol totalnya pada minggu
pertama dan kedua setelah perlakuan. c
Hasil kadar kolesterol yang diperoleh kemudian dianalisis dengan statistik SPSS. g.
Penetapan Kadar kolesterol total Penetapan kadar kolesterol total menggunakan Reagen Kit Cholesterol FS dari
Diasys dengan metode CHOD-PAP enzymatic photometric test. Prinsip dari metode ini adalah pemeriksaan kolesterol setelah hidrolisis dan oksidasienzimatik.Indikator
kolorimetri adalah quinonimin yang terbentuk dari 4-aminoantipirin dan fenol oleh hidrogen peroksidase dengan adanya reaksi katalitik dari peroksidase.
5
Tabel 2.Komposisi reagen Kit DiaSys, 2014
No Nama Bahan
Jumlah
1 Good’s buffer pH 6,7
50 mmolL 2
Phenol 5 mmolL
3 4-Aminoantipyrine
0,3 mmolL 4
Cholesterol esterase CHE ≥ 200 UL
5 Cholesterol oxydase CHO
≥ 50 UL 6
Peroxidase POD ≥ 3 UL
Standart: 200 mgdL 5,2 mmolL Kolesterol Total
Tabel 3. Prosedur pengukuran kadar kolesterol total
Blangko Sampel
standard Sampel standard
- 10 µL
Aquadest 10 µL
- Reagen 1000
1000 Pengukuran kadar kolesterol total dilakukan dengan pengambilan sampel darah
sebanyak 0,5 mL dari vena ekor, kemudian disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 12.000 rpm untuk diambil serumnya. Sebelum pembacaan data kolesterol
total terlebih dahulu dipersiapkan blanko, standar dan sampel serum. Kemudian dicampur bahan sesuai dengan tabel 3 dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37
o
C, kemudian dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer UVVis pada
λ 500 nm terhadap blanko reagen tidak lebih dari 60 menit.
h. Analisis Data
Data hasil pengukuran kadar kolesterol total hewan uji dianalisis menggunakan uji statistik dengan menggunakan program SPSS versi 17. Uji statistik yang dilakukan
adalah uji normalitas, homogenitas, paired t-test, dan ANAVAuntuk menguji kadar kolesterol total sesudah di induksi PTU dan diberi diet tinggi lemak, pemberian
simvastatin dan ekstrak pretest serta pemberian kombinasi ekstrak etanol dauan murbei yang dikombinasi dengan simvasatatin posttest.
6
Reaksi pembentukan warna merah yang terjadi saat pencampuran serumstandart dengan reagen setelah diinkubasi selama 10 menit adalah sebagai berikut:
a
Cholesterol ester+ H
2 CHE
Cholesterol + Fatty acid
b Cholesterol + O
2 CHO
Cholesterol-3-one + H
2
O
2
c 2 H
2
O
2
+ 4-Aminoantypyrine + Phenol
POD
Quinoneimine + 4 H
2
O
Gambar 1.ReaksiMetode CHOD-PAP
DiaSys, 2014; Allain et al, 1974
7
Dipuasakan 25 ekor hewan uji selama 16-18 jam, kemudian diukur kadar kolesterol totalnya baseline.
Gambar 2. Skema Jalannya Penelitian HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
