dan 20 mL NaOH 40, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100
o
C. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 mL yang berisi campuran 10 mL asam borat H
3
BO
3
2 dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume
destilat mencapai 40 mL dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan
warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh.
Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut : N = mL HCl
– mL blanko x N HCl x 14,007 x fp x 100 mg contoh x faktor koreksi alat
Faktor koreksi alat = 2,5 Kadar protein = N x faktor konversi
Faktor Konversi= 6,25
3.3.3 Analisis asam amino AOAC 2005 dengan modifikasi
Komposisi asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan
selama 2-3 jam. Begitu pula syringe yang akan digunakan dibilas dengan akuades. Analisis asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu:
1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; 4 tahap injeksi serta analisis asam amino.
1 Tahap pembuatan hidrolisat protein
Hal yang dilakukan pada tahap pembuatan hidrolisat protein adalah sampel ditimbang sebanyak 3 mg dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis
asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 1 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 110
o
C selama 24 jam. Pemanasan dalam oven dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu
kromatogram yang dihasilkan. Selain itu, pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis.
2 Tahap pengeringan
Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 ml, dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan cairan bilasan
16
dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses ini diulangi hingga 2-3 kali. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan rotary evaporator selama 15-30 menit untuk
mengubah sistein menjadi sistin. Sampel yang sudah kering ditambah dengan 5 ml HCl 0,01 N kemudian disaring dengan kertas saring milipore.
3 Tahap derivatisasi
Larutan derivatisasi dibuat dengan menambahkan buffer kalium borat pH 10,4 pada sampel dengan perbandingan 1:1. Kemudian ke dalam vial kosong yang
bersih masukkan 50 µl sampel dan tambahkan 250 µl pereaksi Ortoflaaldehida OPA dengan perbandingan 1:5, biarkan 1 menit agar derivatisasi berlansung
sempurna. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Larutan stok OPA dibuat dengan cara
mencampurkan 50 mg OPA ke dalam 4 ml metanol dan 0,025 ml merkaptoetanol, dikocok hati-hati dan ditambahkan larutan brij 30 sebanyak 0,050 ml dan buffer
kalium borat 1 M, pH 10,4 sebanyak 1 ml. Simpan larutan dalam botol berwarna gelap pada suhu 4
o
C dan akan stabil selama 2 minggu. 4
Injeksi ke HPLC Injeksikan ke dalam HPLC sebanyak 5 µl. Tunggu sampai pemisahan
semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan sekitar 25 menit. Untuk perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan, dilakukan pembuatan
kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus: µmol asam amino = luas daerah sampel x C x fp
luas daerah standar Keterangan: C = Konsentrasi standar asam amino 0,5 µmolml
fp = faktor pengenceran 5 ml asam amino = µmol AA x Mr AA x 100
µg sampel Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino sebagai berikut:
Temperatur : 27
o
C suhu ruang Jenis kolom HPLC
: Ultra techspere Coloum C-18 Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit
17
Tekanan : 3000 psi
Fase gerak : Buffer Na-Asetat dan methanol 95
Detektor : Fluoresensi
Panjang gelombang : 254 nm
3.3.4 Analisis taurin AOAC 2005
