Klasifikasi Daun Tembakau Nicotiana tabbacum L. Waktu dan Tempat

2.5.2 Viabilitas Spermatozoa mencit Mus musculus L.

Sampai saat ini parameter spermatozoa masih merupakan indikator terpenting pada evaluasi fertilitas pria. Salah satu indikator yang menentukan terjadinya fertilisasi atauterbentuknya embrio adalah viabilitas daya hidup spermatozoa, mengingat faktor tersebut erat kaitannya dengan fungsi spermatozoa itu. Dengan rendahnya viabilitas maka pembuahan tidak akan terjadi sebab spermatozoa mati sebelum membuahi sel telur Rusmiati, 2007.

2.5.3 Motilitas Spermatozoa mencit Mus musculus L.

Gerakan Spermatozoa dikategorikan menurut WHO 1988 antara lain : a. Jika sperma bergerak cepat dan lurus ke depan gerak maju sangat baik b. jika geraknya lambat dan sulit maju lurus atau bergerak tidak lurus gerakan lemah c. jika tidak bergerak maju dan d. jika sperma tidak bergerak

2.6 Klasifikasi Daun Tembakau Nicotiana tabbacum L.

Klasifikasi ilmiah daun tembakau Nicotiana tabbacum L. adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub Kelas : Asteridae Ordo : Solanales Famili : Solanaceae Genus : Nicotiana Spesies : Nicotiana tabaccumL. Cahyono.B, 1998 Bentuk daun tembakau bulat lonjong, ujungnya meruncing, tulang daun menyirip, bagian tepi daun agak bergelombang dan licin. Daun bertangkai melekat pada batang, kedudukan daun mendatar atau tegak. Ukuran dan ketebalan daun tergantung varietasnya dan lingkungan tumbuhnya. Daun tembakau tersusun atas lapisan palisade parenchyma pada bagian atasnya dan spongy parenchyma pada bagian bawah. Jumlah daun dalam satu tanaman berkisar 28-32 helai, tumbuh berselang-seling mengelilingi batang. Daun tembakau secara umum dapat diklasifikasikan menurut letaknya pada batang yang dimulai dari bawah keatas, yaitu: daun pasir, kaki, tengah dan atas. Bagian dari daun tembakau yang mempunyai nilai tertinggi adalah bawah dan tengah menyusul daun atas Abdullah, 1982. Nikotin dihasilkan dari akar tanaman dan selanjutnya didistribusikan didaun melalui batang, dalam bentuk murni merupakan cairan yang tidak berwarna, rasa pahit dan pedas, mudah larut dalam air dan pelarut organik. Tembakau mengandung bahan aktif golongan alkaloid. Kandungan bahan kimia terpenting dalam daun tembakau adalah zat nikotin, biasanya dalam bentuk Nicotin sulfat Cahyono.B, 1998. BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2015 - Juli 2015 di Laboratorium Fisiologi Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. 3.2Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL yang terdiri dari 6 perlakuan yaitu 3 kontrol dan 3 perlakuan yaitu kontrol 0 K0 adalah kontrol negatif yang diberi akuades, kontrol 1 K1 adalah kontrol positif yang diberi ekstrak daun tembakau, kontrol 2 K2 adalah kontrol positif yang diberi jus buah delima dan perlakuan 1 P1, 2 P2 dan 3 P3 yang diberi estrak daun tembakau dan jus buh delim dengan konsentrasi yang berbeda 4, 5, 6. Jumlah ulangan untuk setiap perlakuan ditentukan dengan menggunakan rumus Federer dalam Chairul dkk., 1992 yaitu: t-1 n-1 ≥ 15, dimana:t = jumlah perlakuan dan n= jumlah ulangan. Baik kelompok kontrol maupun perlakuan masing-masing terdiri dari lima ulangan sehingga mencit yang digunakan berjumlah 6 X 4 = 24 ekor. Tabel. 3.2.1 Rancangan Percobaan Mencit Keterangan: K0 = Kontrol - akuades K1 = Kontrol + ektrak daun tembakau K2 = Kontrol + jus buah delima P1 = ekstrak daun tembakau + jus buah delima 4, P2 = ekstrak daun tembakau + jus buah delima 5 P3 = ekstrak daun tembakau + jus buah delima 6 n = jumlah ulangan. Kontrol Perlakuan P1 P2 P3 Akuades K2 n=4 Ekstrak daun K1 n=4 Jus buah delima K2 n=4 Ekstrak daun tembakau+jus buah delima 4 n=4 Ekstrak daun tembakau +jus buah delima 5 n=4 Ekstrak daun tembakau +jus buah delima 6 n=4 3.3Prosedur Percobaan 3.3.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan mencit jantan dewasa Mus musculus L. sebagai hewan percobaan. Kisaran umur mencit yang digunakan sekitar dua bulan dengan berat badan 20-22 gram, sebelum diberi perlakuan, 24 ekor mencit jantan dewasa yang digunakan sebagai percobaan diaklimatisasi selama 7 hari. Kandang yang digunakan selama pemeliharaan berupa bak plastik yang berukuran panjang 39 cm, lebar 31 cm dan tinggi 15 cm yang ditutup dengan penutup kawat, dialasi dengan sekam dan diberi pakan setiap hari selama 35 hari. 3.3.2Pembuatan Jus Buah delimaPunica granatum L. Jus buah delima dibuat dari buah delima merah produk lokal. Setelah dipetik, buah delima dicuci bersih. Buah dikupas dari kulitnya. Ditimbang buah sebanyak 250 gram. Diblender buah delima dan disaring. Jus buah delima dibuat dalam konsentrasi yang berbeda yaitu 4, 5 dan 6 dengan penambahan akuades sebanyak 100 ml, jus buah delima disimpan dilemari es pada suhu 4 C Aviram et al, 2000.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak Daun Tembakau Nicotiana tabaccum L.

Daun tembakau dipotong kecil-kecil, dikeringanginkan selama 48 jam, diblender sampai berbentuk serbuk, ditimbang daun tembakau sebanyak 800 g, dimasukan kedalam botol dan dimeserasi serbuk daun tembakau dengan reagen methanol selama 48 jam sampai terendam. Hasil meserasi disaring dengan kertas saring dan diperoleh filtrat. Residu yang ada direndam kembali dengan pelarut methanol 96 . Hal ini dilakukan secara berulang hingga diperoleh filtrat jernih. Kemudian filtrat yang diperoleh dipisahkan dengan rotavapor, filtrat dimasukkan kedalam beaker glass. Ekstrak diasamkan dengan penambahan HCl 2N sampai PH=2 yang dicek dengan kertas lakmus, diekstraksi dengan CHCl 3 untuk menghilangkan senyawa organic non alkaloid, filtrate dimasukkan kedalam corong pemisah,dimasukkan kedalam beaker glass, ditambahkan filtrat dengan NaOH sampai PH=10 yang dicek dengan kertas lakmus, ditambahkan CHCl 3 , dipisahkan dengan corong pemisah, diuapkan sampai menghasilkan ekstrak kental sebanyak 4,653 gram Harbone,J.B, 1998. Dilarutkan ekstrak sebanyak 46,53 mg dengan akuades sebanyak 100 ml dengan dosis 0.121 mgbb Nugraheni et al., 2003.

3.3.4 Pemberian Perlakuan

Pada perlakuan kontrol negatif K0 mencit hanya diberi akuades saja. Pada perlakuan kontrol positif K1 mencit hanya diberi ekstrak daun tembakau sebanyak 0,1 ml, dan pada kontrol positif K2 mencit diberi jus buah delima sebanyak 0,1 ml. Pada perlakuan 1 P1 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus buah delima dengan konsentrasi 4 sebanyak 0,1 ml dan pada perlakuan 2 P2 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus buah delima dengan konsentrai 5 sebanyak 0,1 ml dan perlakuan 3 P3 diberikan ekstrak daun tembakau dan jus buah delima dengan konsentrasi 6 sebanyak 0,1 ml. Dosis pemberian ekstrak tembakau sebanyak 0.121 mg0,1 mlhari. Dosis jus buah delima dengan berat 250g untuk mencit yaitu 0,1 mlhari wahyuni etal., 2013. Pemberian jus buah delima yaitu 0,1 ml pada mencit. Hal ini dikarenakan kapasitas lambung mencit 1 ml Suganto, 2011. Pemberian ekstrak daun tembakau dan jus buah delima menggunakan jarum gavage yang diberikan setiap hari selama 35 hari dan dilakukan pembedahan dan pengamatan spermatozoa pada hari ke 36. 3.4Variabel yang diamati 3.4.1 Jumlah spermatozoa Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa. Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µL , dimasukkan ke dalam kotak hemositometerImproved Neubauer dan ditutup dengan cover glass. Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali dan dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa. Gambar 3.3.5.1Kamar Hitung Improved Neubauer Zaneveld et al., 1986 Pengamatan jumlah sperma dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad 1983, Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam rumus: Jumlah spermatozoa = N2 x 10 5 spermatozoaml suspensi Dimana, N = Jumlah spermatozoa yang dihitung dalam kotak 10 5 = Bidang permukaan kamar hitung 3.4.2 Morfologi Spermatozoa Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa.Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µ L, dimasukkan ke dalam kotak hemositometerImproved Neubauerdan ditutup dengan cover glass.Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali dan dilakukan perhitungan persentase jumlah spermatozoa yang normal dan abnormal. Untuk mendapatkan hasil akhirnya, jumlah persentase sperma yang normal kiri dan kanan kauda epididimis dijumlah kemudian diambil rata-ratanya. Ciri sperma normal yaitu mempunyai bentuk kepala seperti kait pancing dan ekor panjang lurus, sedangkan sperma yang abnormal mempunyai bentuk kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti kepala tidak beraturan, dapat berbentuk seperti pisang, atau tidak beraturan amorphus, atau terlalu bengkok, dan ekornya tidak lurus bahkan tidak berekor, atau hanya terdapat ekornya saja tanpa kepala WHO, 1988. Spermatozoa normal Spermatozoa Normal = x 100 100 spermatozoa normalabnormal 3.4.3 Viabilitas Spermatozoa Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa. Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µL, dimasukkan ke dalam kotak hemositometerImproved Neubauer,diberi giemsa 3 dan ditutup dengan cover glass. Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali dan dilakukan perhitungan viabilitas spermatozoa. Spermatozoa yang hidup tidak berwarna dan yang mati berwarna kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 400x dan dihitung terhadap 100-200 spermatozoa. Sebagai hasilnya dinyatakan dalam bentuk persen hidup yang didapat dari hasil bagi jumlah spermatozoa hidup dengan jumlah total spermatozoa hidup dan mati yang dikalikan dengan 100 WHO, 1988. spermatozoa hidup Spermatozoa Hidup = x 100 100 spermatozoa hidupmati 3.4.4 Motilitas Spermatozoa Mencit Mus musculus L. dibedah, dipotong bagian kauda epididimis dan distal vas deferens. Kauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi NaCl 0,9, dan dilakukan pemotongan dengan pisau silet biasa.Suspensi sperma yang telah homogen diambil dengan pipet tetes 50µ L, dimasukkan ke dalam kotak hemositometerImproved Neubauer dan ditutup dengan cover glass.Spermatozoa diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali dan dilakukan perhitungan motilitas spermatozoayang bergerak cepat, tidak bergerak, dan bergerak lamban WHO, 1988.

3.4 Analisis Data