Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
114
6.2.7 Resolusi
Apabila dilakukan campuran dua analit dengan metode HPLC maka akan didapat dua puncak yang mempunyai waktu tambat yang
berbeda. Sedangkan tujuan utama dari analisis dengan metoda HPLC adalah didapatkannya pemisahan yang lebih baik. Oleh karena itu
diperlukan parameter yang dapat menggambarkan pemisahan kromatogram analit tersebut. Parameter yang diperlukan tersebut
adalah: resolusi Rs dan faktor pemisahan atau faktor selektivitas yang dinyatakan sebagai
α . Fakt or pemisahan
α menggambarkan pemisahan
antara dua puncak relatif terhadap satu sama lain, dan dinyatakan dengan persamaan berikut:
o R
o R
t t
t t
k k
− −
= =
1 2
1 2
α
..................................... 6.8
Dimana α
harus 1. Resoluasi Rs mengukur perbedaan waktu tambat t
R
dari duamacam analit yang dibagi dengan lebar dasar puncaknya w.
5 ,
2 1
1 2
w w
t t
Rs
R R
+ −
=
................................... 6.9 Jadi dapat dikatakan bahwa faktor pemisahan
α hampir sama dengan
resolusi Rs, yang membedakan antara keduanya adalah pada resolusi melibatkan waktu tambat dan lebar dasar puncak, sedangkan faktor
pemisahan hanya melibatkan waktu tambat saja pemisahan bagian atas dari kromatogram.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
115 Gambar 6.9 Pemisahan dua analit
Apabila dua puncak tidak dapat terpisah dengan sejati, maka penentuan lebar dari puncak dapat dilihat pada Gambar 6.10.
Gambar 6.10 Dua puncak yang tidak terpisah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
116 Untuk mencapai resolusi yang optimal diperlukan persamaan sebagai
berikut:
2 1
1 1
25 ,
N k
k Rs
+
− =
α α
..................... 6.10 α
= faktor pemisahan k = rata-rata faktor kapasit as dari dua puncak
N = rata-rata jumlah pelat Harga resolusi sangat bervariasi dari dua analit yang mempunyai
harga Rs = 1-1,5 dapat dikatakan dua kromatogram dari dua puncak tersebut terpisah 98 – 99,7 . Apabila dua puncak menghasilkan harga
reslusi yang kecil atau bahkan 1, maka dua puncak tersebut saling berhimpitan overlapping
6.2.8 Faktor Simetri
Faktor simetri disebut juga tailing factor TF yaitu terjadinya
pengekoran pada kromatogram sehingga bentuk kromatogram menjadi tidak simetris. Gambar dibawah ini menunjukkan bagaimana mengukur
besarnya TF dinyatakan dengan angka nisbah : TF = BC AC = b a
Gambar 6.11 Mengukur besarnya TF pada kromatogram
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
117 Untuk kromatogram yang memberikan harga TF = 1 berarti
kromatogram tersebut betul-betul simetris. Harga TF 1 berarti
kromatogram tersebut mengekor tailing, makin besar harga TF maka makin efisien kolom yang dipakai. Bila harga TF
1 berarti kromatogram tersebut mengandung fronting, dan dapat diatasi dengan mengurangi
volume injeksi awal. Jadi harga TF dapat digunakan sebagai pedoman untuk melihat efisiensi kolom kromatografi. Hubungan efisiensi kolom
dengan yang dicerminkan oleh harga N dengan TF atau AF Asymetrycal dirumuskan oleh Foley dan Dorsey sebagai berikut :
25 ,
1 7
, 41
1 ,
+ +
= b
a W
t N
T
............................. 6.11 Harga W
0,1
adalah berat lebar celah kromatogram pada posisi 10 dari dasar kromatogram tinggi puncak. Salah satu penyebab
terjadinya pengekoran kromatogram adalah ketidakcocokan sampel dengan jenis yang dipakai.
6.3 I nstrumentasi HPLC