Bahan dan Alat Bahan dan Metode .1 Tempat dan Waktu

Tabel 4.1 Individu mutan putatif lada Ciinten yang digunakan untuk penanda morfologi dan SSR No. Individu No. Individu No. Individu 1 R.I.25.3 11 B.I.25.16 21 B.II.25.2 2 R.I.25.4 12 B.I.50.1 22 B.II.25.6 3 R.I.25.5 13 B.I.50.2 23 B.II.25.26 4 R.I.25.13 14 B.I.50.7 24 B.III.25.6 5 R.II.25.3 15 B.I.50.10 25 B.III.25.9 6 R.II.25.5 16 B.I.50.13 26 B.III.25.17 7 R.II.25.11 17 B.I.50.16 27 B.III.25.28 8 R.III.25.8 18 B.I.50.17 28 Kontrol 9 R.III.25.12 19 B.I.50.18 10 B.I.25.14 20 B.II.25.1 Keterangan: B = Fase Benih dan R= Fase Benih dengan Radikula 4.2.3 Metodologi Penelitian 4.2.3.1 Penanda Morfologi Metode dan pelaksanaan untuk analisis morfologi yaitu meliputi karakter pertumbuhan yang terdiri dari karakter kuantitatif dan kualitatif. Pengamatan pertumbuhan vegetatif dilakukan saat pertumbuhan optimal yaitu 8 BST. Karakter yang diamati yaitu tinggi tanaman, panjang daun, lebar daun, jumlah daun, jumlah ruas, jumlah cabang berdasarkan IPGRI. 4.2.3.2 Penanda Molekuler SSR Analisa molekuler dilakukan saat pertumbuhan morfologi pada populasi M1 mencapai 3-4 daun. Sampel daun dari beberapa tanaman terseleksi diambil untuk dianalisis keragamannya dengan penanda SSR. Analisa ini akan dilakukan dengan menggunakan beberapa primer Tabel 4.2. Isolasi DNA menggunakan sampel daun tanaman diambil dan digerus dalam mortar menggunakan pestle dengan menambahkan buffer eksraksi CTAB sebanyak ±700µL Doyle Doyle 1990. Sampel digerus hingga merata dan dipindahkan ke dalam 1,5 mL microtube dengan menggunakan pipet. Microtube direndam dalam water bath bersuhu 65 C selama 30 menit, lalu diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit. Sebanyak 700 µL CIA ditambahkan ke dalam sampel dan dibolak-balik secara perlahan agar larutan tercampur. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit. Larutan DNA berwarna bening di bagian atas atau supernatan akan memisah dari larutan chloroform yang tercampur dengan bagian sel lainnya berwarna hijau pada fase bawah. Fase atas dipindah ±500-600 µL dipindah ke microtube baru. Alkohol dingin absolute 2x volume atau isopropanol 1x volume sampel ditambahkan dan dibolak-balik secara perlahan, lalu sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Sampel disentrifugasi dalam kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 C selama 10-15 menit. Supernatan dibuang DNA berupa endapan pada dasar microtube. Endapan DNA dicuci dengan 70 ethanol, lalu dikeringanginkan di suhu ruang ± 15 – 20 menit. DNA dilarutkan menggunakan ddH 2 O sebanyak 50-100 µL dan disimpan pada suhu -20 C. Penentuan kuantitas DNA dengan Spektrofotometer: DNA diencerkan 100x dengan cara 15 µL DNA dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 mL dan ditambahkan aquades hingga 1,5 mL. Setting spektrofotometer ke 260 nm dan dibuat blanko. Sampel diencerkan ke dalam kuvet dan dihitung absorbansinya Konsentrasi atau kuantitas DNA dapat dihitung dengan persamaan : Konsentrasi DNA µgmL = 50 µgmL x nilai absorbansi pada A260 x Faktor pengenceran Proses PCR dilakukan dengan komposisi reaksi yaitu DNA Sampel 2 µl, PCR Mix 6 µl, primer SSR 0.5 µl, air bebas ion sebanyak 4 µl. PCR dijalankan dengan predenaturasi pada suhu 94ºC selama 4 menit, denaturasi pada susu 94ºC selama 4 menit, annealing pada suhu 37ºC selama 1 menit, amplifikasi 72ºC selama 1 menit, ekstensi 72ºC selama 5 menit dan proses PCR ini akan diulang sebanyak 35 siklus. Tabel 4.2 Primer yang digunakan untuk analisa SSR pada tanaman lada Lokus Nomor aksesi dalam bank gen Primer Sequence 5-3 Psol3 JQ924478 F: CACGACGTTGTAAAACGACGCGGATCTTACCAGAATCAG R: GAGTAGCCTTTGGTTGTTGC Psol6 JQ924481 F: CACGACGTTGTAAAACGACCTCTTGGCAAAAGTCACCTG R: ATCCCATACCGATCTCCTTC Psol9 JQ924484 F: CACGACGTTGTAAAACGACGGAACCCACGAGTTTCTTG R: GGGGTCCTTTTTACGTTGAG Psol10 JQ924485 F: CACGACGTTGTAAAACGACCAGACGGATTCCCACTGAT R: GGACTTGTAACCCATCGAGA Psol11 JQ924486 F: CACGACGTTGTAAAACGACTTATTTGGTTGGAGCTGTGTG R: CCACGGTGGGTTATCACAC Psol15 JQ924490 F: CACGACGTTGTAAAACGACCGCGGACTAACCAGAGTTAC R: GCCACAAAAACCCACTCA Psol16 JQ924491 F: CACGACGTTGTAAAACGACGAAGTCCTAACCAGACCTGTG R: GAGGTGTTGTTGATGTGAGC Psol17 JQ924492 F: CACGACGTTGTAAAACGACTATTCCCATGCGAGATGC R: CGGCATAACCACTAAACCAC Psol18 JQ924493 F: CACGACGTTGTAAAACGACACTGTTGTGGACCTTGTTGC R: TGTATTAGGCCCCATCGAC Sumber: Yoshida et al. 2014 Penentuan hasil PCR dilakukan dengan menggunakan elektroforesis vertikal yaitu akrilamid dimasukkan ke dalam electrophoresis chamber yang berisi buffer TBE 1x dengan memastikan bagian atas gel berada di posisi katodakutub negatif. Sejumlah hasil PCR 3-5 µL ditambahkan dengan loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam well. Elektroforesis dilakukan menggunakan gel akrilamid dalam elektroforesis vertikal pada 80 V, selama 60 menit. Gel diwarnai dengan larutan ethidium bromide atau staining chemical lain selama 10 menit lalu dibilas dengan ddH 2 O selama 20 menit. Gel akrilamid dideteksi atau divisualisasi dengan menggunakan sinar UV pada UV Transilluminator. Ethidium Bromide EtBr sebagai pewarna pada proses staining akan berikatan dengan DNA dan cahaya akan berpendar saat terpapar oleh sinar UV. Hasil pendaran tersebut membuat DNA dapat tervisualisasi oleh kamera gel doc kemudian difoto untuk diinterpretasikan.

4.2.4 Analisis Data

Analisis data yang dilakukan meliputi analisis kesamaa dan analisis pengelompokkan. Data hasil pengamatan karakter morfologi kuantitatif dan kualitatif menggunakan minitab, sedangkan pola pita DNA diubah menjadi data biner dengan cara scoring. Nilai 1 jika pita ada dan nol 0 jika pita tidak ada. Data biner untuk menghitung nilai kemiripan genetika menggunakan prosedur SIMQUAL Similarity for Qualitative Data pada program NTSYSpc versi 2.01 dan dihitung berdasarkan DICE dengan menggunakan rumus Nei Li 1979. Seluruh data pola pita DNA dianalisis menggunakan prosedur SAHN Sequencial, Agglomerative, Hierarchical and Nested dengan metode UPGMA unweighted pair-group method, arithmetic average pada program NTSYSpc versi 2.01. Hasil analisis ditampilkan dalam bentuk dendogram. 4.3 Hasil dan Pembahasan 4.3.1 Keragaman Mutan Putatif Lada Ciinten Berdasarkan Penanda Morfologi Hasil pengamatan terhadap karakter daun menunjukkan bahwa terdapat keragaman atau perubahan beberapa karakter daun pada mutan putatif lada Ciinten dengan lada Ciinten yang tidak diiradiasi. Perubahan tersebut terdapat pada bentuk daun, bentuk dasar daun dan pinggir daun. Bentuk daun pada lada varietas Ciinten merupakan bentuk bulat telur, sedangkan lada hasil iradiasi, nomor 1, 7, 9, 13, 14, 15, 17, 21 berbentuk bulat telur lanset dan individu hasil iradiasi nomor 2, 10, 12, 19, 24 berbentuk bulat telur elips. Bentuk pangkal daun lada varietas Ciinten adalah menjantung sedangkan mutan putatif 7, 8, 13, 14, 15, 16, 18, 21 memiliki bentuk pangkal daun membulat dan lada hasil iradiasi nomor 5 memiliki bentuk pangkal daun runcing. Pinggir tepi daun lada varietas Ciinten adalah lurus, sedangkan lada hasil iradiasi nomor 1, 3, 15, 18, 20, 26 memiliki pinggir daun yang bergelombang. Keragaman ini disebabkan adanya perlakuan iradiasi sinar gamma. Sama halnya dengan penelitian Suhesti 2015 pada tebu, yang menyatakan bahwa terdapat keragaman atau perubahan beberapa karakter daun mutan terhadap tetua yaitu pada karakter kelengkungan helaian daun, tinggi dan kedudukan telinga daun serta warna segitiga daun. Tabel 4.3 Bentuk daun mutan putatif lada varietas Ciinten No Individu Bentuk Daun Bulat telur Bulat telur elips Bulat telur lanset Elips lanset Menjantung Kontrol √ 1 R.I.25.3 √ 2 R.I.25.4 √ 3 R.I.25.5 √ 4 R.I.25.13 √ 5 R.II.25.3 √ 6 R.II.25.5 √ 7 R.II.25.11 √ 8 R.III.25.8 √ 9 R.III.25.12 √ 10 B.I.25.14 √ 11 B.I.25.16 √ 12 B.I.50.1 √ 13 B.I.50.2 √ 14 B.I.50.7 √ 15 B.I.50.10 √ 16 B.I.50.13 √ 17 B.I.50.16 √ 18 B.I.50.17 √ 19 B.I.50.18 √ 20 B.II.25.1 √ 21 B.II.25.2 √ 22 B.II.25.6 √ 23 B.II.25.26 √ 24 B.III.25.6 √ 25 B.III.25.9 √ 26 B.III.25.17 √ 27 B.III.25.28 √ Keterangan: R fase benih dengan radikula, B fase benih, I- III ulangan, 25Gy dan 50 Gy dosis iradiasi, 1-28 nomor tanaman