Metode Pelaksanaan Penelitian .1 Bahan Penelitian

4.5 Metode Pelaksanaan Penelitian 4.5.1 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah 1. Biji alpukat 2 kg 2. Etanol 70 6 liter Rudang, Indonesia 3. Akuades 1 liter Rudang, Indonesia 4. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 Laboratorium Rumah Sakit Penyakit Tropis Infeksi, Surabaya, Indonesia 5. Trypticase Soy Agar TSA dan Trypticase Soy Broth TSB 6. NaCl 0,9 Rudang, Indonesia

4.5.2 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah 1. Timbangan Home Line, China 2. Timbangan analitik Vibra, Japan 3. Kertas perkamen 3 kajang 4. Blender Panasonic, Japan 5. Kapas 250 gram Bio Panca, Indonesia 6. Kertas saring Whatman no. 42, England 7. Aluminium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia 8. Perkolator 9. Erlenmeyer Pyrex, USA 10. Vaccum rotavapor Stuart, 2010 11. Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument Company , USA 12. Autoklaf Tomy, Japan 13. Vortexwhirli mixer Iwaki model TM-100, Japan 14. Inkubator CO2 Sanyo, Japan 15. Pipet mikro Gilson, France 16. Piring petri Pyrex, Japan Universitas Sumatera Utara 17. Transiluminator 18. Ose dan spiritus 19. Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan 4.5.3 Prosedur Penelitian 4.5.3.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Alpukat Persea americana Mill. Proses pembuatan ekstrak etanol siwak dilakukan berdasarkan Standar Operasional Prosedur Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dan panduan Farmakope Indonesia tahun 1995 dengan langkah-langkah sebagai berikut: a. Pembuatan simplisia Biji alpukat dipotong kecil-kecil dan ditimbang sebanyak 2 kg. Biji alpukat dicuci dengan air mengalir, dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40 ○ C selama 7 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila biji alpukat telah mudah dipatahkan. Biji alpukat yang telah dikeringkan tersebut kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 415 gram biji alpukat yang telah kering. Selanjutnya biji alpukat kering tersebut dihaluskan dengan blender dan didapat serat-serat halus biji alpukat simplisia. Gambar 7. Proses pengeringan biji buah alpukat Universitas Sumatera Utara Gambar 8. Proses penghalusan biji alpukat b. Proses maserasi Sebanyak 300 gramserbuk simplisia diletakkan ke dalam bejana tertutup dan dimaserasi dengan etanol 70 selama 15 menit dengan suhu 25 ○ C. Gambar 9. Proses maserasi biji alpukat Universitas Sumatera Utara c. Proses perkolasi Perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol 70 dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyaring untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Cairan penyaring ditambahkan berulang-ulang etanol 70 secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyaring di atas simplisia pada penelitian ini total etanol 70 yang dituangkan ke dalam simplisia adalah sebanyak 2 liter, hingga diperoleh ekstrak cair jumlah ekstrak cair yang dihasilkan adalah sebanyak 1,5 liter. Gambar 10. Proses perkolasi biji alpukat Universitas Sumatera Utara d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 40 ○ C selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari hingga konsistensi seperti madu. Ekstrak yang telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik. Setelah itu ekstrak etanol biji alpukat dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di tempat yang sejuk. 4.5.3.2 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Dilusi 4.5.3.2.1 Pembuatan Suspensi Bahan Uji Ekstrak biji alpukat dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Trypticase Soy Broth TSB. TSB dibuat dengan komposisi1 liter TSB = 30 gram serbuk TSB + 1 liter air. TSB kemudian disterilkan dalam autoclave selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121 ○ C. Beberapa buah tabung disediakan dan pada masing-masing tabung berisi 4 ml TSB. Pada tabung pertama diberi 4 gram esktrak kental biji alpukat kemudian dicampur dengan menggunakan vortex sehingga didapatkan ekstrak etanol biji alpukat dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan pengenceran berganda dengan cara mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak etanol biji alpukat 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung kedua untuk mendapatkan ekstrak etanol biji alpukat 50 pengenceran berganda. Cara yang sama dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi25,12,5, 6,25, dan 3,125 masing-masing tabung tersebut diberi label sesuai konsentrasi.

4.5.3.2.2 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media TSA. TSA dibuat dengan komposisi 1 liter TSA= 30 gram serbuk TSB + 20 gram serbuk TSA + 1 liter air. Campuran tersebut lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih dan merata. Setelah masak, TSA disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121 ○ C, lalu disimpan dalam lemari pendingin. Universitas Sumatera Utara Jika digunakan, media dipanaskan kembali hingga mendidih dan siap untuk dituang ke dalam petri.

4.5.3.2.3 Pembiakan Spesimen

Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen cell line Porphyromonas gingivalis ATCC33277 yang dibiakkan secara murni pada media TSA dalam suasana anaerob pada inkubator CO 2 hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri lalu disuspensikan dalam larutan 0,9 NaCl hingga diperoleh kekeruhan sesuai 0,5 Mac Farland Standard atau setara dengan jumlah 1 x 10 8 CFU ml CFU: Colony Forming Unit

4.5.3.2.4 Penentuan KHM Bahan Coba

Konsentrasi ekstrak etanol biji alpukat yang diuji dalam penelitian ini adalah dimulai dari 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Dari semua konsentrasi tersebut direplikasi sebanyak 4 kali. Dari masing-masing tabung dengan konsentrasi tersebut ditambahkan 100 µl suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian divorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37 ○ C selama 4 jam pada inkubator CO 2 . Amati kekeruhan yang terjadi, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM, yaitu konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis.

4.5.3.2.5 Penentuan KBM Bahan Coba

Hasil pengujian penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode Pour plate. Dengan metode ini dapat dihitung jumlah koloni bakteri hidup yang telah disuspensikan dalam bahan coba. Setelah diinkubasi pada proses penentuan KHM, bahan coba dari konsentrasi seperti di atas divorteks dan diambil 100 µl untuk setiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam petri kemudian tuang media TSA cair dan homogenkan dengan metoda angka 8, Universitas Sumatera Utara diamkan selama 15-20 menit sampai mengering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO 2 dengan suhu 37 ○ C selama 24 jam. Kemudian, dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Koloni Porphyromonas gingivalis pada media padat berbentuk bulat dan berwarna putih keruh. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dibuat rata- ratanya dan dikalikan dengan faktor pengencer dan faktor pengali. Misalkan pada perhitungan jumlah koloni menggunakan pengenceran sebanyak 5 kali dan volume bahan coba 100 µl maka faktor pengenceran = 10 5 dan faktor pengali = 10 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml Contoh cara perhitungan koloni pada metode Pour plate adalah a. Pada media padat ditetesi sebanyak 100 µl suspensi bahan coba dengan mikropipet dan dilakukan pengenceran sebanyak 5 kali. b. Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dan didapatkanlah sebanyak 5 koloni. c. Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah 5 x 10 5 faktor pengenceran x 10 faktor pengali = 50 x 10 5 CFU ml.

4.6 Pengolahan dan Analisis Data