20
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara Medan meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, skrining fitokimia, pemeriksaan karakteristik simplisia, pembuatan
ekstrak etanol daun ketepeng. Fraksinasi dengan pelarut n-heksana dan etilasetat.Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar menggunakan
cakram kertas terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, dan Pseudomonas aeruginosa.
3.1 Alat-alat
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat- alat gelas, aluminium foil, alat tanur, blender Philips, cakram kertas Oxoid, cawan petri,
inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kaca objek, kamera Lenovo, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200 L, lampu Bunsen, lemari
pendingin Toshiba, lemari pengering, mikroskop cahaya, otoklaf Fisons, oven Memmert, penangas air, penguap vakum Haake D, pinset, pipet mikro
Eppendorf, dan timbangan analitik Mettler Toledo.
3.2 Bahan-bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun ketepeng Senna alata L.Roxb.. Bahan kimia yang digunakan kecuali
dinyatakan lain berkualitas proanalisa E.Merck: amil alkohol, asam asetat
Universitas Sumatera Utara
21 anhidrat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzena, besi
III klorida, bismuth III nitrat, dimetilsulfoksida DMSO, etanol, etilasetat, iodium,isopropanol,kalium iodida, kloroform,metanol,natrium hidroksida, natrium
klorida, n-heksana, raksa II klorida,serbuk magnesium, timbal II asetat, toluene,
α-naftol, serta air suling, nutrient agar dan nutrient broth. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
dan Pseudomonas aeruginosa.
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.3.1 Pembuatan larutan pereaksi
3.3.1.1 Pereaksi Mayer
Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL. Pada wadah lain, 50 g kalium iodida dilarutkan dalam 100 mL air suling.
Kemudian 60 mL larutan I dicampurkan dengan 10 mL larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 mL Depkes, RI., 1989.
3.3.1.2 Pereaksi Bouchardhat
Sebanyak 4 g Kalium Iodida ditimbang kemudian dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g
iodium sedikit demi sedikit. Setelah semuanya larut, dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 mL Depkes, RI., 1989.
3.3.1.3 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g Natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL Ditjen, POM., 1979.
3.3.1.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismuth II nitrat dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat dan
Universitas Sumatera Utara
22 dilarutkan27,2 g kalium iodida dalam 50 mL air suling. Campur kedua larutan dan
dicukupkan dengan air suling hingga 100 mL Depkes, RI., 1989.
3.3.1.5 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air
suling hingga 100 mL, lalu disaring Ditjen, POM., 1979. 3.3.1.6 Pereaksi asam klorida 2 N
Asam klorida pekat sebanyak 16,6 mL ditambahkan air suling sampai 100 mL Ditjen, POM., 1979.
3.3.1.7 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 mL Depkes, RI., 1989.
3.3.1.8 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak sepuluh tetes asam asetat anhidrat dicampurkan dengan satu tetes asam sulfat pekat. Larutan harus selalu dibuat baru saat akan
digunakan.Depkes, RI., 1989.
3.3.1.9 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 mL etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes,
RI., 1989.
3.3.2 Pembuatan Media 3.3.2.1 Media nutrient agar
Komposisi nutrient agar adalah 5 g Peptone from meat, 3 g Meat extract, 12 g agar, dan air suling ad 1 L. Cara pembuatan: Sebanyak 20 g nutrient agar
ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling sebanyak 1000 mL, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna. Disterilkan didalam autoklaf pada suhu 121
o
C
Universitas Sumatera Utara
23 selama 15 menit Merck, 2005.
3.3.2.2 Media nutrient broth
Komposisi nutrient broth adalah 5 g Peptone, 3 g Meat extract, air suling ad 1 L. Cara pembuatan:Sebanyak 8 g media nutrient broth NB dilarutkan
dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna,
kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Merck, 2005.
3.3.2.3 Pembuatan agar miring
Sebanyak 3 mL media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diletakkan pada sudut kemiringan 30-45
o
dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994.
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di
otoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan alat- alat gelas di oven pada suhu 160-170
o
C selama 1-2 jam, sedangkanjarum ose dan pinset dengan cara dibakar dengan nyala bunsen Lay, 1994.
3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang
digunakan adalah daun ketepeng Senna alata L.Roxb.diambil dari Kelurahan
Universitas Sumatera Utara
24 Padang Bulan Selayang II Kecamatan Medan Selayang, Kota Medan Provinsi
Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI Bogor.
3.5.3 Pembuatan simplisia
Daun ketepeng Senna alata L.Roxb.dicuci bersih dari kotoran dengan air sampai bersih dan ditiriskan.Kemudian diangin-anginkan atau dibiarkan
diruangan terbuka tanpa terkena cahaya matahari langsung.Daun ketepeng dianggap kering apabila sudah rapuh atau dapat dipatahkan dengan cara diremas.
Kemudian simplisia daun ketepengyang telah kering dihaluskan menggunakan blender sehingga menjadi serbuk simplisia, dan disimpan dalam wadah plastik
yang tertutup rapat.
3.6 Karakterisasi Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Kategori