Desain penelitian Tempat dan waktu penelitian Definisi operasional Alur penelitian Analisis data

15

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Desain penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan hewan coba.

3.2. Tempat dan waktu penelitian

3.2.1. Tempat penelitian akan dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta 3.2.2. Waktu penelitian pada bulan September 2012 hingga Febuari 2013.

3.3. Sampel dan metode pengambilan sampel

Sampel penelitian akan diambil secara konsekutif dari tikus putih jantan Sprague dawley yang telah mengalami maturasi skeletal 8-12 minggu dengan berat antara 150 – 250gr hingga besar sampel tercapai.

3.3.1 Besar sampel

Perkiraan besar sampel ditentukan berdasarkan rumus Federer: dengan: n = besar sampel k= jumlah kelompok perlakuan Penelitian memerlukan empat kelompok perlakuan sehingga didapatkan: kelompok Bila diantisipasi drop kemungkinan drop out seb esar 10 didapatkan n’ sebesar 70.7 = 8 ekorkelompok. Penelitian ini terdiri atas empat kelompok sehingga besar sampel yang diperlukan sebesar 32. Universitas Sumatera Utara 16

3.3.2. Alokasi sampel

Sampel akan dialokasi secara acak ke dalam kelompok kontrol dan perlakuan menggunakan tabel alokasi acak. 3.4. Variabel penelitian 3.4.1. Variabel terikatdependen Variabel terikatdependen penelitian adalah gambaran radiologis penyatuan tulang dan gambaran histologis.

3.4.2. Variabel independenbebas

Variabel independenbebas penelitian adalah implantasi amnion liofilisasi steril radiasi, dan kombinasi implantasi amniotic membrane AM dengan autograft

3.5. Definisi operasional

1. Defek tulang dinyatakan sebagai kehilangan tulang sebesar 4mm 2. Xenograf yang dipakai adalah yang berasal dari sapi morcalized bovine dari BATAN. 3. Scaffold dalam rekayasa jaringan adalah struktur buatan yang mampu menyangga pembentukan jaringan, tiga dimensi. 4. Amnion liofilisasi steril radiasi ALS-steril adalah membrane amnion AM yang sudah disterilkan dengan cara radiasi. 5. Fiksasi interna adalah fiksasi tulang dengan menggunakan implant kirschner wire 1,0 mm 6. Penyatuan tulang dinyatakan sebagai waktu yang diperlukan mulai dari terjadinya defek hingga terjadinya penyatuan radiologis, dinyatakan dalam satuan minggu. 7. Penyatuan radiologis dinyatakan sebagai penyatuan tulang dinilai dari gambaran radiologis, dimana kalus telah diresorbsi dan garis fraktur tidak lagi dapat dibedakan 8. Gambaran histologis dinyatakan sebagai gambaran histologis jaringan yang diperiksa dengan mikroskop cahaya menggunakan pulasan hematoksilin eosin pada Universitas Sumatera Utara 17 perbesaran 10x dan 40x. Pemeriksaan dilakukan pada daerah 7.5 mm sentral dari graft . 9. Nilai radiologis: Penyembuhan tulang secara radiologis menurut penelitian Lane dan Sandhu yang dimodifikasi. 10. Nilai histologis: Penyembuhan fraktur dinilai secara histologis setelah dilakukan pewarnaan Hematoxilyn Eosin HE berdasarkan skoring penyembuhan fraktur menurut skor modifikasi Salkeld.

3.6. Cara kerja

3.6.1. Alokasi subjek

Hewan coba dialokasikan acak ke dalam empat kelompok perlakuan yaitu kelompok 0 kontrol, Kelompok 1, kelompok 2 dan kelompok 3

3.6.2. Intervensi

Terhadap setiap kelompok akan dibuat fraktur dengan defek tulang sepanjang 4mm. Defek tulang pada kelompok kontrol tidak di intervensi. Pada kelompok 1, defek tulang diisi dengan amnion liofilisasi steril radiasi Bank Jaringan Riset Batan,Indonesia. Kelompok 2 defek tulang diisi dengan xenograft. Kelompok 3 mendapatkan kombinasi implantasi amnion liofilisasi steril radiasi dengan xenograft. Setiap kelompok akan mendapat fiksasi interna dengan intramedulari k wire.

3.6.2.1 Tindakan anestesi hewan coba

Setiap hewan coba ditimbang untuk menghitung dosis zat anestesi yang dibutuhkan. Zat anestesi yang digunakan adalah campuran ketaminxilazine 60-80 mgkg + 5-10 mgkg secara intraperitoneal.

3.6.2.2 Tindakan operasi fraktur dan fiksasi interna

Setelah dianestesi, dilakukan pencukuran dan disinfeksi dengan menggunakan betadine pada daerah operasi. Kulit hewan coba diinsisi secara longitudinal pada permukaan lateral diafisis femur. Pada setiap kelompok perlakuan akan dibuat fraktur di pertengahan diafisis berikut periosteum yang melapisinya. Fraktur dibuat dengan cara Universitas Sumatera Utara 18 digergaji menggunakan bone saw dengan konfigurasi garis fraktur transversal pada dua tempat dengan jarak 4mm. Segmen tulang yang dibatasi kedua garis fraktur tersebut dikikir sehingga didapatkan defek tulang sebesar 4mm. Defek tulang diisi menurut alokasi kelompok. Fiksasi interna dilakukan dengan intramedullary k wire. Jaringan lunak ditutup lapis demi lapis hingga ke kulit.

3.7. Protokol Penelitian

3.7.1. Preparasi Jaringan

Semua tikus dimatikan pada akhir minggu ketujuh dan masing-masing kruris difiksasi dengan menggunakan larutan formalin 10 selama satu hari. Kemudian dilakukan dekalsifikasi dengan larutan HCl selama satu hari. Proses selanjutnya adalah dehidrasi, sediaan direndam dalam alkohol 70, 80, 95 selama masing-masing tiga jam kemudian direndam dalam alkohol absolut 100 tiga kali masing-masing selama tiga jam. Berikutnya adalah clearing process , sediaan direndam dengan larutan Xylol dua kali, masing-masing selama tiga jam. Langkah selanjutnya infiltration embedding process , dimana sediaan dimasukkan dalam paraffin cair bersuhu 45°C. Sediaan kemudian didinginkan pada suhu kamar dan setelah keras, dipotong dengan mikrotom secara longitudinal. Tiap bahan dari blok parafin dibuat 3 slide diwarna dengan Hematoxylin-Eosin.

3.7.2 Pemeriksaan Histologi

Penilaian inkorporasi autograft dinilai secara histologis setelah dilakukan pewarnaan Hematoxilyn Eosin HE berdasarkan skoring penyembuhan fraktur menurut Salkeld yang dimodifikasi.Dilihat daerah osteotomi proksimal dan distal. Nilai skor histologi merupakan jumlah nilai dari osteotomi proksimal dan distal. Skor mulai dari 0 sampai 8. ?? Universitas Sumatera Utara 19 Tabel 1 . Skor histologi Salkeld yang dimodifikasi Kualitas penyembuhan Tidak terdapat penyembuhan Penyembuhan dengan fibrous 1 Penyembuhan fibrokartilago atau kartilago 25 2 Penyembuhan fibrokartilago atau kartilago 26-50 Penyembuhan fibrokartilago atau kartilago 51-75 Penyembuhan fibrokartilago atau kartilago 75 3 4 5 Penyembuhan tulang dengan kartilago termineralisasi 6 Penyembuhan tulang matur 7 Salkeld SL, Patron LP, Barrack RL, Cook SD. J Bone Joint Surg Am 83:2001; 6:803 –816

3.7.3 . Pemeriksaan Radiologi

Penilaian inkorporasi graft tulang secara radiologis berdasarkan skor radiologi menurut Lane dan Sandhu. Tabel 2. Skor Radiologi menurut Lane dan Sandhu yang dimodifikasi ?? BONE FORMATION No evidence of bone formation 1 2 3 4 Bone formation occupying 25 of defect Bone formation occupying 50 of defect Bone formation occupying 75 of defect Bone formation occupying 100 of defect UNION Nonunion 2 4 Possible union Radiographic union REMODELING No evidence of remodeling 1 2 Remodeling of intramedullary canal Full remodeling of cortex Maximum score 10 Lane J M, Sandhu H S. Current approaches to experimental bone grafting. Orthop Clin North Am 1987; 18: 213-25. Turkiye Klinikleri J Med Sci 2010;302:623-30 Universitas Sumatera Utara 20

3.8. Alur penelitian

3.9. Analisis data

Perbedaan rerata tebal kalus dan gambaran histologis antar kelompok akan diuji dengan menggunakan uji anova satu arah. Perbedaan dinyatakan signifikan bila p0.05. Penyatuan tulang diuji dengan uji kesintaan survival analysis . Analisis data dilakukan dengan menggunakan program STATA versi 10 StataCorp, Texas, Amerika. 28 tikus putih jantan Sprague dawley yang dewasa secara skeletal dengan berat antara 300-350gr Kelompok 1 Kelompok 3 Kelompok 2 Fraktur femur dengan defek jaringan sepanjang 4mm amnion liofilisasi steril radiasi + xenograft Xenograft amnion liofilisasi steril radiasi Fiksasi interna dengan intramedullary k wire Gambaran radiologis penyatuan tulang dan gambaran histologis setelah 6 minggu. Kontrol Universitas Sumatera Utara 21

BAB IV HASIL PENELITIAN

Penelitian dilakukan secara eksperimental pada diáfisis tulang tibia tikus jantan jenis Sprague Dawley berusia 8-12 minggu dengan berat badan 150-250 gram pada bulan September 2012 sampai Desember 2012. Sebanyak 32 sampel terkumpul secara acak. Tikus dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing berjumlah 8 ekor tikus sebagai kelompok kontrol tanpa pengisian defek tulang, 8 ekor tikus sebagai kelompok perlakukan 1 defek diisi dengan amnion, 8 ekor tikus sebagai kelompok 2 defek diisi dengan xenograft dan 8 ekor tikus lainnya sebagai kelompok 3 defek diisi dengan kombinasi amion dan xenograft. Terhadap setiap kelompok akan dibuat fraktur dengan defek tulang sepanjang 4mm. Defek tulang pada kelompok kontrol tidak di intervensi. Pada kelompok 1, defek tulang diisi dengan amnion liofilisasi steril radiasi Bank Jaringan Riset Batan,Indonesia. Kelompok 2 defek tulang diisi dengan xenograft. Kelompok 3 mendapatkan kombinasi implantasi amnion liofilisasi steril radiasi dengan xenograft. Setiap kelompok akan mendapat fiksasi interna dengan intramedulari k wire. Pada minggu ke -7, seluruh sampel diharvest untuk dilakukan pemeriksaan radiologis dan pemeriksaan histopatologis HE di laboratorium Departemen Histologi FK-UI RSCM. Semua 32 sampel tikus berada dalam keadaaan hidup selama perjalanan penelitian namun tiga sampel dieksklusi dari penelitian, satu sampel dari kelompok kontrol dan dua sampel lain dari kelompok perlakuan. Sampel yang tereksklusi disebabkan karena protusi K- Wire. Universitas Sumatera Utara