11
3.3.5 Pemeliharaan Kultur
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan. Botol-botol disusun dengan rapi sehingga memudahkan dalam
pengamatan. Botol kultur setiap hari disemprot dengan menggunakan alkohol 70 untuk mengurangi tingkat kontaminasi. Pemeliharaan kultur dilakukan
selama ± 5 bulan. Eksplan yang terkontaminasi segera dikeluarkan dari rak kultur agar tidak mengkontaminasi kultur yang lainnya.
3.3.6 Analisis Histologi
Embrio somatik
yang terbentuk
selanjutnya diamati
fase embriogenesisnya, dengan melakukan analisis histologi menggunakan metode
paraffin Johansen 1940 yang terdiri atas:
3.3.6.1 Fiksasi
Fiksasi dilakukan dengan cara setiap sampel direndam dalam larutan Formalin 40, Alkohol 70, asam asetat glacial dengan perbandingan 1 : 8 : 1
FAA Formaldehyde Acetic-acid Alcohol dengan komposisi 10 mL formalin, 80 mL alkohol, dan 10 mL asam asetat glacial dalam setiap 100 mL larutan direndam
minimal selama 24 jam dan diletakkan dalam vaccum pump. Tujuan perendaman dengan FAA adalah untuk mematikan sel pada sampel secara cepat tetapi seolah-
olah sampel seperti kondisi masih segar masih hidup.
3.3.6.2 Dehidrasi
Tujuan dehidrasi untuk menghilangkan air yang ada dalam jaringan tanaman, dilanjutkan dengan penghilangan alkohol. Dehidrasi dilakukan dengan
merendam sampel secara bertahap melalui seri alkohol bertingkat dari alkohol 70 sampai alkohol absolut sampel masih di dalam vaccum pump. Sampel
dimasukkan ke dalam botol yang telah diberi campuran alkohol dan xylol dengan perbandingan 3:1, 1:1 dan 1:3 vv secara berturut-turut. Tahap dehidrasi masing-
masing dilakukan minimal 3 jam.
Universitas Sumatera Utara
12
3.3.6.3 Infiltrasi
Infiltrasi adalah memasukkan parafin secara perlahan-lahan ke dalam rongga-rongga yang kosong dalam jaringan tanaman agar tidak terjadi kerusakan
sampel pada saat penyayatan. Pada tahap ini, sampel yang telah direndam dalam xylol diberi serbuk parafin secara perlahan-lahan sampai jenuh. Bahan yang
digunakan adalah xilol dan parafin yang sudah dicairkan dengan perbandingan 3:1; 1:1 dan 1:3 vv secara berturut-turut sebanyak tiga kali selama 3 jam. Proses
ini dilakukan di dalam oven pada suhu 55
o
C setelah kegiatan tersebut selesai, semua parafin diganti dengan parafin murni pada suhu 60
o
C. Perendaman dengan parafin murni dilakukan minimal selama 24 jam.
3.3.6.4 Embedding Penanaman
Embedding adalah penanaman sampel yang sudah diproses sebelumnya ke dalam blok parafin untuk mempermudah penyayatan. Penanaman dilakukan pada
kotak dari cetakan kertas. Sampel yang sudah difiksasi dimasukkan ke dalam cetakan yang telah berisi parafin cair dengan menggunakan pinset. Sampel
dikeluarkan dari cetakan setelah parafin mengeras.
3.3.6.5 Penyayatan
Kategori