12 dengan populasi 7.000 ekor ayam diambil 9 sampel dan peternakan B dengan
populasi 10.000 ekor ayam diambil 12 sampel.
2. Ekstaksi DNA
Sebanyak 100 µ
l sampel darah dengan antikoagulan dimasukkan kedalam tabung mikro yang sudah diisi dengan 500
µ l Dr. GenTLE
TM
Sollution 1. Sedian dihomogenasasikan menggunakan vortex selama 10 detik, lalu didiamkan selama
10 menit pada suhu kamar20
O
C. Campuran disentrifius 12.000 g selama 5 menit pada suhu kamar, kemudian supernatan dikeluarkan hingga hanya tertinggal
endapan. Endapan yang ada ditambah dengan 1000 µ
l larutan Sollutin II dan disentrifius 12.000 g selama 2 menit pada suhu kamar. Supernatan kembali
dibuang, endapan yang tersisa ditambahkan dengan Sollution III sebanyak 500 µ
l dan divortex selama 10 detik, kemudian disentrifius 12.000 g selama 5 menit
pada suhu kamar. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru dan steril, setelah itu supernatan ditambah 500
µ l isoprophanol dan dihomogenesasikan.
Campuran disentrifius 12.000 g selama 5 menit pada suhu 4 C dan supernatan
dikeluarkan sampai kering, setelah itu endapan yang ada ditambahkan 1000 µ
l ethanol 70 dan kembali disentrifius 12.000 g selama 5 menit pada suhu 4
C. Supernatan kembali dikeluarkan dan endapan yang tersisa ditambahkan 1000
µ l
alkohol 100 dan disentrifius 12.000 g selama 5 menit pada suhu 4 C.
Supernatan dikeluarkan dengan hati-hati supaya DNA tidak ikut terbuang. Endapan DNA yang tersisa dikeringkan setelah itu ditambahkan 25
µ l buffer TE.
Template DNA disimpan pada freezer dengan suhu -80 C.
3. Perbanyakan Rangkaian DNA Spesifik
Metode PCR menggunakan dua pasang primer yaitu pada putaran I OMP 1 dan OMP 2 dan putaran II OMP 3 dan OMP 4. PCR mixture I terdiri dari
milli q water 12 µ
l, 10X buffer 2.5 µ
l, dNTP 2.0 µ
l, MgCl
2
3.0 µ
l, OMP1 0.2 µ
l, OMP2 0.2
µ l, taq DNA polymerase 0.1
µ l, DNA sampel 5.0
µ l. PCR mixture II
terdiri dari milli q water 12 µ
l, 10X buffer 2.5 µ
l, dNTP 2.0 µ
l, MgCl
2
3.0 µ
l, OMP3 0.2
µ l, OMP4 0.2
µ l, taq DNA polymerase 0.1
µ l, DNA sampel 5.0
µ l.
PCR diatur 36 siklus 94 C selama 1 menit, 54
C selama 1 menit dan 72 C selama
1 menit. Hasil tes disimpan pada suhu 4 C.
13
4. Elektroforesis
Kategori