Jalur Biosintesis IAA pada Bakteri Bahan Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Penghasil IAA dari Akar Tanaman Padi Oryza sativa L.

sekitar 10. Di samping itu, Azospirillum dapat meningkatkan jumlah serabut akar padi, tinggi tanaman, dan menambah konsentrasi fitohormon asam indol asetat AIA dan asam indol butirat AIB bebas di daerah perakaran. Azospirillum Brasilense memberi pengaruh terhadap perkembangan akar gandum Bottini et al, 1989; Okon et al, 1988; Barbieri et al, 1986; Barbieri Galli, 1993 dalam Lestari et al, 2007. Azospirillum yang menghasilkan IAA mampu mempercepat pertumbuhan tanaman, perkembangan akar lateral, merangsang kerapatan dan panjang rambut akar, yang pada akhirnya menyebabkan peningkatan serapan hara pada tanaman padi sehingga meningkatkan tinggi tanaman padi dan menjadikan bakteri ini berfungsi sebagai pupuk bakteri Lestari et al, 2007. Beberapa mikroorganisme tanah yang menghasilkan IAA seperti Azospirillum sp., Enterobacter sp., Azotobacter sp., Klebsiella sp., Alcaligenes faecalis, Azoarcus sp., Serratia sp., Cyanobacteria dan bakteri sulfur dapat mendorong pertumbuhan tanaman Rubio et al, 2000. Azotobacter chroococcum, A. vinelandii dan A. paspali mampu menghasilkan auksin Azcon Barea, 1975. Efek Azotobacter dalam meningkatkan biomassa akar disebabkan oleh penghasilan asam indol asetat di daerah perakaran. Hal ini didukung bukti bahwa eksudat akar mengandung triptofan atau senyawa serupa yang dapat digunakan oleh mikroorganisme tanah untuk memproduksi asam indol asetat Dewan Subba Rao, 1979. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari akar padi. Identifikasi dengan menggunakan metode kalorimeter, densitomery dan bioassays dapat mengidentifikasi bakteri penghasil hormon IAA Rubio et al, 2000. Bakteri endofit penghasil IAA yang berhasil diisolasi dari akar tanaman adalah Agrobacterium tumafaciens dan Azotobacter vinelandii Khan Sharon, 2008.

2.5 Jalur Biosintesis IAA pada Bakteri

Jalur indole-3-acetamide IAM adalah jalur biosintesis yang terdapat dalam bakteri. Jalur ini terdiri dari dua langkah adalah yang pertama triptophan dikonversikan ke IAM oleh enzim trytophan-2-monooxygenase IaaM, dikode oleh gen IaaM. Langkah kedua IAM dikonversi menjadi IAA oleh enzim IAM hydrolase IaaH, dikode oleh 8 Universitas Sumatera Utara gen IaaH. Jalur IAM ini spesifik ditemukan pada bakteri bukan pada tanaman. Jalur indole-3-piruvat IPyA diperkirakan menjadi jalur utama untuk biosintesis IAA pada tanaman. Namun, enzim dan gen yang berperan dalam jalur ini, belum teridentifikasi pada tanaman. Pada bakteri, produksi IAA melalui jalur IPyA telah diketahui. Langkah pertama jalur ini adalah konversi tryptophan ke IPyA oleh aminotransferase transaminasi. Jalur IPyA adalah dekarboksilase untuk indole-3-asetaldehida IAAId oleh indole-3-piruvat dekarboksilase IPDC. Pada langkah terakhir IAAId dioksidasi menjadi IAA Gambar 1 Spaepen et al., 2007. Gambar 1. Biosintesis IAA dari Azospirillum brasilense 9 Universitas Sumatera Utara BAB 3 BAHAN DAN METODA

3.1 Bahan

Bahan yang dipakai pada penelitian ini adalah akar tanaman padi, biji padi, fungisida agrep, larutan tween 80, alkohol 70, larutan sodium hipoklorit 5, akuades, media pertumbuhan, media Luria Bertani cair, larutan Mc Farland dan reagen Salkowski Lampiran A, hal. 25.

3.2 Metoda Kerja

3.2.1 Isolasi bakteri endofit

Bakteri endofit diisolasi dari akar tanaman padi yang telah dibersihkan dengan air mengalir selama 20 menit. Permukaan akar tanaman padi disterilkan dengan merendamnya berturut-turut di dalam larutan alkohol 70 selama 2 menit, larutan hipoklorit 5 selama 5 menit dan alkohol 70 selama 30 detik, kemudian dibilas dengan akuades steril sebanyak dua kali Radu Kqueen, 2002. Akar yang telah steril dihaluskan dengan lumpang secara aseptis, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi akuades steril dengan perbandingan 1:10 dan dibuat pengenceran sampai 10 3 . Suspensi cair tersebut diambil sebanyak 1 ml dan disebarkan pada media pertumbuhan dengan metode cawan sebar dan diinkubasi selama 24 jam Isolat yang diperoleh disubkultur dan dibuat biakan murninya. Isolat tersebut dikarakterisasi morfologi koloni, bentuk sel, pewarnaan gram, dan uji biokimianya yang terdiri dari uji sitrat, gelatin, katalase, TSIA dan pati Lay, 1994. Universitas Sumatera Utara

3.2.2 Pembuatan Kurva Standart IAA Aryantha et al., 2004.

IAA sintesis ditimbang sebanyak 0,001 gram dan dilarutkan kedalam 100 ml akuades. IAA sintesis dimasukkan ke dalam labu takar dan dibuat pengenceran dengan konsentrasi 0; 0,1; 0,4; 0,8; 1,2; 1,4 ppm. Setiap konsentrasi diambil 2 ml dan ditambahkan 1 ml pereaksi Salkowski, kemudian dihomogenkan selama 30 menit sampai 60 menit dan absorbansinya diukur dengan spektrofotometer λ= 530 nm. 3.2.3 Kemampuan Bakteri Endofit dari Akar Tanaman Padi dalam Menghasilkan IAA secara In vitro dan Pertumbuhan Koloni Bakteri Untuk mengetahui kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan IAA, dilakukan dengan mengkulturkan isolat yang diperoleh ke dalam media Luria Bertani cair + L- tryptophan. Biakan isolat diambil sebanyak 3 ml dengan kekeruhan setara Mc Farland Bresson dan Borges, 2004, kemudian dimasukkan ke dalam 30 ml media Luria Bertani cair + L-tryptophan. Kultur dishaker selama enam hari pada suhu 28 C dan dengan kecepatan 150 rpm. Setiap dua hari sekali cairan kultur yang telah dishaker diambil sebanyak 0,1 ml untuk menghitung jumlah koloni dengan metode SPC standart plate count Lay, 1994 dan dihitung jumlah CFU colony forming units dan diambil sebanyak 3 ml untuk menghitung kadar IAA yang dihasilkan oleh bakteri endofit. Cairan kultur tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 25 menit. Supernatan yang diperoleh, kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril dan diuji kemampuannya dalam menghasilkan IAA dengan metode kolorimetri dengan pemberian reagen Salkowski Patten dan Glick, 2002 dengan perbandingan 2:1 supernatan:salkowski Zahir et al, 1997. Campuran tersebut diinkubasi selama 60 menit dan absorbannya diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 530 nm. Konsentrasi IAA dari setiap isolat dapat diketahui dengan cara memasukkan nilai absorban supernatan ke persamaan garis kurva standart IAA yang telah diperoleh. 11 Universitas Sumatera Utara

3.2.4 Introduksi Bakteri Endofit Penghasil IAA Pada Kecambah Padi

Introduksi bakteri endofit dilakukan pada kecambah tanaman padi yang steril. Untuk mendapatkan kecambah steril maka biji padi ditumbuhkan dalam media agar steril. Biji padi dibersihkan permukaannya terlebih dahulu dengan cara dicuci di bawah air mengalir selama lima menit, kemudian direndam di dalam botol yang berisi Agrep fungisida dan ditambahkan dua tetes larutan tween 80, kemudian dishaker selama 30 menit dengan kecepatan 120 rpm. Biji yang telah dishaker dicuci dengan akuades steril, kemudian disterilkan dengan larutan kloroks 10 dengan dishaker selama 15 menit dan dicuci kembali dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Biji tersebut direndam kembali dengan larutan kloroks 5 dengan dishaker selama 15 menit, kemudian dicuci dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Tahapan terakhir, biji direndam di dalam alkohol 70 selama satu menit dan dibilas dengan akuades steril Suryowinoto, 1996. Biji padi yang telah steril ditanam ke dalam media agar. Biji tersebut ditumbuhkan selama satu minggu dan diletakkan pada ruangan yang kurang cahaya, kemudian kecambah muda dipindahkan ke dalam wadah steril. Kecambah tersebut direndam ke dalam suspensi biakan yang telah disetarakan kekeruhannya dengan larutan Mc Farland 10 8 selml selama dua jam. Kecambah yang direndam dengan akuades digunakan sebagai kontrol, masing-masing perlakuan diulang sebanyak enam kali. Setiap kecambah yang telah direndam dalam suspensi biakan ditanam pada media tanah steril di dalam polybag. Kecambah yang tumbuh diamati setelah dua minggu. Parameter yang diamati adalah tinggi tanaman, panjang akar dan berat basah kecambah. 12 Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Penghasil IAA dari Akar Tanaman Padi Oryza sativa L.

Isolat bakteri endofit dari akar tanaman padi pada dua lokasi berbeda diperoleh sebanyak 12 isolat yaitu 7 dari Medan Md dan 5 dari Binjai Bj. Setiap isolat memiliki karakter morfologi koloni, bentuk sel, gram, motilitas dan sifat biokimia yang berbeda. Isolat yang diperoleh menunjukkan bentuk koloni circular, irregular dan filamentus. Tepi yang bervariasi dengan didominansi oleh elevasi flat. Koloni bakteri berwarna putih, krem, kuning dan orange. Bakteri endofit yang diperoleh lebih dominan gram positif dan hanya dua isolat yang gram negatif. Sel yang berbentuk basil lebih dominan dibanding bentuk coccus. Semua bakteri bersifat motil, katalase bersifat negatif dan sebagian dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, menghidrolisa gelatin, menghidrolisa pati serta memfermentasi gula Tabel 1. Tabel 1. Karakteristik Bakteri Endofit Isolat Morfologi Gram Bentuk sel Motilitas Uji Biokimia Bentuk Tepi Elevasi Warna S G P TSIA K Md 1 Circular Undulate Flat Krem Positif Basil Pedang - - - Glukosa - Md 2 Circular Undulate Flat Orange Negatif Basil Berjonjot + - - Glukosa - Md 3 Circular Entire Flat Krem Positif Basil Berjonjot - - - Glukosa - Md 4 Circular Entire Flat Putih Positif Basil Pedang + - - - - Md 5 Irregular Curled Convex Krem Positif Basil Bertonjol + - - Glukosa - Md 6 Irregular Undulate Umbonate Putih Positif Basil Pedang - - - Glukosa - Md 7 Irregular Lobate Convex Krem Positif Basil Berjonjot - - - Glukosa - Bj 1 Irregular Lobate Raised Putih Positif Coccus Pedang - + - Laktosa Sukrosa - Bj 2 Circular Entire Flat Kuning Negatif Coccus Pedang + + - Laktosa Sukrosa - Bj 3 Circular Entire Flat Putih Positif Coccus Pedang + + - Laktosa Sukrosa - Bj 4 Irregular Undulate Flat Putih Positif Basil Berjonjot - - + Laktosa Sukrosa - Bj 5 Filamen Filamentus Flat Putih Positif Basil pedang + - + Laktosa Sukrosa - Keterangan: Md = Isolat dari Medan dan Bj = Isolat dari Binjai Universitas Sumatera Utara Mikroorganisme dapat dikarakterisasi dengan menumbuhkannya di suatu media tumbuh dan merangsangnya untuk berkembang biak setelah periode inkubasi. Pada media padat, pertumbuhan mikroorganisme ditandai dengan bentuk koloni yang berbeda seperti circular, irregular dan lain sebagainya. Satu spesies ditandai dengan satu bentuk koloni, tepi, elevasi dan warna Case Johnson, 1984. Pewarnaan dengan menggunakan zat warna bertujuan untuk melihat bentuk sel bakteri dan menggolongkannya ke dalam kelompok bakteri gram positif dan negatif. Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup seperti halnya bakteri. Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat dari kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi Lay, 1994. 4.2 Kemampuan Bakteri Endofit dari Akar Tanaman Padi dalam Menghasilkan IAA secara In vitro dan Pertumbuhan Koloni Bakteri. Kedua belas isolat endofit yang diperoleh mampu menghasilkan IAA dengan konsentrasi yang bervariasi. Isolat Md dan Bj diperoleh dari tanaman padi yang varietasnya sama yaitu IR64 tetapi waktu pengambilan akarnya berbeda. Isolat Md diambil dari akar tanaman padi yang telah panen sedangkan isolat Bj diambil dari akar tanaman padi yang dua minggu lagi masa panen. Hal ini yang mungkin menyebabkan variasi konsentrasi hormon IAA yang dihasilkan oleh bakteri endofit sehingga mengalami kenaikan dan penurunan dari hari kedua sampai hari keenam. Bakteri tersebut juga diduga memiliki kemampuan yang cepat dalam mensintesis triptofan menjadi IAA sehingga kadar IAA tertinggi didapat pada hari kedua. Bakteri lain, Bj 2 dan Bj 3 memiliki kemampuan yang lebih lambat dalam mensintesis triptofan sehingga konsentrasi IAA tertinggi baru didapat pada hari keenam. Disamping itu, perbedaan asal isolat dan jenis isolat tersebut menyebabkan konsentrasi IAA bervariasi. Pada hari kedua konsentrasi IAA tertinggi sebanyak 1,002 ppm oleh isolat Md 1 dan terendah sebanyak 0,207 ppm oleh isolat Bj 2. Pada hari keempat konsentrasi IAA tertinggi sebanyak 1,050 ppm oleh isolat Bj 2 dan terendah sebanyak 14 Universitas Sumatera Utara 0,374 ppm oleh isolat Md 1. Pada hari keenam konsentrasi IAA tertinggi sebanyak 1,090 ppm oleh isolat Bj 2 dan terendah sebanyak 0,110 ppm oleh Isolat Md 1 Tabel 5, hal. 27. Ketiga isolat ini yang akan diintroduksi ke kecambah padi disebabkan karena memiliki kemampuan yang cepat dan yang lambat dalam menghasilkan IAA. Gambar 2. Histogram Analisis Konsentrasi IAA Secara In vitro. IAA diproduksi pada fase eksponensial. Produksi IAA akan meningkat seiring umur bakteri sampai fase stasioner Tien et al, 1979 dalam Lestari et al, 2007. Hal ini berarti bakteri Md 1 sampai Md 7 telah mengalami fase lag, eksponensial, stasioner dan kematian sehingga mengalami penurunan konsentrasi IAA sedangkan Bj 1 sampai Bj 5 masih sampai pada fase stasioner sehingga terus mengalami kenaikan konsentrasi IAA dari hari ke-2 sampai ke-6. Konsentrasi IAA yang dihasilkan oleh bakteri endofit pada penelitian ini lebih tinggi dari konsentrasi yang diperoleh oleh El-Tarabily et al yaitu 13, 25 μgml sampai 28,62 μgml dengan waktu inkubasi 5 hari tanpa penambahan triptofan tetapi menggunakan media glucose peptone broth GPB. Ahmad et al 2005, memperoleh konsentrasi IAA dari 1,47 μgml sampai 11,88 μml dengan waktu inkubasi 15 hari di dalam media Nutrient Broth dan 10,4 μml sampai 28,3 μml dengan waktu inkubasi 7 hari di dalam media Nutrient Broth dengan penambahan satu mg triptofan. Leveau Lindow 2005, melaporkan bahwa dengan penambahan 4,5 mM triptofan ke dalam media maka konsentrasi IAA semakin meningkat setiap dua jam sekali. Patten Glick 2001, melaporkan bahwa dengan 15 Universitas Sumatera Utara penambahan konsentrasi triptofan yang bervariasi dapat menghasilkan konsentrasi IAA yang berbeda dan semakin tinggi konsentrasi triptofan maka konsentrasi IAA yang dihasilkan juga tinggi. Penambahan 5 mM L-triptofan menghasilkan konsentrasi IAA yang bervariasi untuk setiap jenis bakteri dan menyebabkan konsentrasi IAA tersebut menurun dengan waktu inkubasi yang berbeda. Pada inkubasi 72 jam dengan konsentrasi IAA tertinggi sebanyak 297 ppm dan terendah sebanyak 11 ppm Akbari et al., 2007. Biosintesis IAA oleh mikroba dapat ditingkatkan dengan penambahan triptofan eksogenus sebagai prekursor Arsyad et al dalam Kresnawaty et al., 2008. Bakteri yang menghasilkan IAA dapat ditumbuhkan di dalam media pertumbuhan yang mengandung triptofan yang penting dalam pembentukan IAA Bric et al, 1991. Bakteri yang mengandung IAA tersebut dapat dimanfaatkan sebagai penghasil senyawa metabolit sekunder seperti yang terkandung di dalam tanaman inangnya Simanjuntak et al, 2002. Bakteri endofit dapat menghasilkan hormon yang merupakan senyawa metabolit sekunder yang mirip dengan tanaman inangnya Tan Zou, 2001. Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri endofit menunjukkan jumlah koloni yang berbeda. Bakteri endofit yang diperoleh mengalami kenaikan jumlah koloni dari hari kedua sampai hari keenam Tabel 2 dari jumlah awal ≈ 10 7 selml. Tabel 2. Pertumbuhan Jumlah Koloni Bakteri Endofit Penghasil IAA Isolat Hari ke-2 CFUml Hari ke-4 CFUml Hari ke-6 CFUml Md 1 1,06x10 11 1,09x10 13 0,88 x 10 15 Md 2 1,07x10 11 1,06x10 13 1,12 x 10 15 Md 3 0,92x10 11 1,22x10 13 1,01 x 10 15 Md 4 1,01x10 11 1,21x10 13 1,03x 10 15 Md 5 1,05x10 11 1,02x10 13 1,08 x 10 15 Md 6 1,17x10 11 1,21x10 13 1,01 x 10 15 Md 7 1,08x10 11 1,07x10 13 1,04 x 10 15 Bj 1 1,25x10 11 0.62x10 13 0,31 x 10 15 Bj 2 1,03x10 11 0,51 x 10 13 0,25 x 10 15 Bj 3 1,06x10 11 0,53 x 10 13 0,26 x 10 15 Bj 4 1,12x10 11 0,56 x 10 13 0,28 x 10 15 Bj 5 1,08x10 11 0,54 x10 1\3 0,27 x 10 15 16 Universitas Sumatera Utara Bakteri tersebut menggunakan nutrisi yang ada di dalam media dan menggunakan hormon yang dihasilkannya untuk dipakai kembali pada proses pertumbuhan. Selain ketersediaan nutrisi, pertumbuhan sel dipengaruhi oleh keadaan dan jumlah sel awal ketika diinokulasikan ke media serta jenis bakteri tersebut Lay Hastowo, 1992. Produksi IAA mengalami penurunan dan jumlah koloni meningkat hal ini berarti setelah periode kenaikan IAA beberapa nutrisi dalam medium mengalami penurunan. Jadi bakteri masih mampu memproduksi IAA dan secara simultan bakteri juga mengkonsumsi IAA meskipun medium pertmbuhan sudah miskin nutrisi Lestari et al, 2007. IAA disintesis sebagai metabolit sekunder yang dihasilkan dalam kondisi pertumbuhan bakteri suboptimal atau saat tersedia prekursor asam amino triptofan TRP Lucyanie, 2009.

4.3 Introduksi Bakteri endofit dalam Mendukung Perkecambahan Tanaman Padi Oryza sativa L..