Media Pertumbuhan Morfologi Pengaruh faktor fisikokimia terhadap pembentukan pigmen oleh bakteri laut Mesophilobacter sp.

23

3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Bahan dan alat

3.1.1 Bahan

1. Mikroorganisme Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri laut Gram-negatif yang diisolasi dari terumbu karang di Florida, Amerika Serikat yang disediakan oleh Center of Marine Biotechnology, University of Maryland.

2. Media Pertumbuhan

Media yang digunakan terdiri dari media padat dan cair. Media padat berfungsi untuk memelihara stok bakteri, yang dimodifikasi dari komponen nutrien agar Tortora et al., 1986. Media ini mengandung ekstrak khamir 2 gl, pepton 5 gl, NaCl 20 gl, agar 20 gl. Komposisi ekstrak khamir dapat dilihat pada Tabel 5. Media cair berfungsi sebagai media pertumbuhan bakteri dan pembentukan pigmen. Media cair terdiri dari ekstrak khamir 2 gl, pepton 5 gl, NaCl 20 gl dan trace element 5 mll. Komposisi trace element adalah Na 2 EDTA 4,36 mgl, FeCl 3 6H 2 O 3,15 mgl, CuSO 4 5H 2 O 0,01 mgl, ZnSO 4 7H 2 O 0,02 mgl, CoCl 2 6H 2 O 0,01 mgl, MnCl 2 4H 2 O 0,18 mgl, dan Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,006 mgl. Untuk mempelajari pengaruh karbon dan nitrogen dalam pertumbuhan dan pembentukan pigmen dari bakteri laut, maka digunakan juga media cair yang terdiri dari sumber karbon dan sumber nitrogen. Sumber karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah glukosa, asetat, sitrat,dan maltosa. Sumber nitrogen yang digunakan adalah pepton, ekstrak khamir, NH 4 2 SO 4, dan NaNO 3 . Selain sumber karbon dan nitrogen, di dalam medium cair juga ditambahkan NaCl dan trace element. Bahan kimia lainnya adalah alkohol, HCl, NaOH dan metanol. 24 Tabel 5 Komposisi ekstrak khamir Komponen mgg Vitamin µgg Total nitrogen Amino nitrogen Khlorida NaCl Berat Kering Phosphat P 2 O 5 Karbohidrat Sodium Pottasium Kalsium Besi Magnesium Tembaga Seng Mangan Kobalt 75 – 108 34 – 48 0,7 – 13 300 38 82 56 30 0,1 0,05 2 0,05 0,05 0,005 0,005 Thiamin Riboflavin Asam nukleat Asam pantotenat Piridoksin Biotin Inositol Kolin 10 20 400 50 25 1 1500 1500 Sumber : Bridson and Brecker 1970 in Sikyta 1983

3. Penentuan Gram pada Identifikasi Bakteri

Bahan yang digunakan untuk identifikasi gram bakteri laut adalah : kristal violet, larutan lugol, etanol 95, aseton, safranin dan aquades.

3.1.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi, cawan petri, labu erlenmeyer, batang pengaduk, pipet, penjepit, lup inokulasi, vortex mixer, inkubator, timbangan analitik, autoklaf, gelas ukur, sentrifus, clean bench, inkubator goyang, spektrofotometer, refrigerator, kertas pH, tissue dan aluminium foil.

3.2 Metode penelitian

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap. Tahap pertama penelitian adalah identifikasi bakteri. Tahap kedua adalah penelitian yang bertujuan untuk mencari suhu, pH, cahaya dan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen. Tahap ketiga adalah penelitian yang bertujuan untuk mengetahui pengaruh sumber karbon dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen. 25 Selain itu, sebelum penelitian dimulai dilakukan pembuatan media untuk stok bakteri dan penyegaran bakteri yang digunakan dalam proses fermentasi, dengan langkah-langkah sebagai berikut : a Pembuatan media padat Pembuatan media dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml dengan volume medium 250 ml. Komposisi media padat terdiri dari pepton 5 g, ekstrak khamir 2 g, NaCl 20 g, dan agar 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades, pH medium diatur pada 7. Media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o b Penyegaran bakteri C selama 15 menit. Setelah itu media dituang ke dalam cawan petri, masing-masing sebanyak 20 ml secara aseptik. Setelah media dingin dan padat, siap digunakan untuk penyegaran bakteri. Bakteri digoreskan pada media padat secara aseptik. Setelah itu bakteri diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 30 o C selama 24 jam.

3.2.1 Penelitian tahap petama: Identifikasi bakteri

Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan morfologi dan ciri-ciri fisiologi bakteri.

1. Morfologi

1. Pewarnaan Gram Bakteri dioles di atas gelas obyek sebanyak satu lup dan diratakan dengan aquades secukupnya hingga ukuran 1 x 1 cm, kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Tetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Dicuci dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit. Bilas dengan aquades, kemudian dibilas lagi dengan campuran etanol 95 sebanyak 80 ml dan aseton 20 ml, selama 1 menit. Dibilas kembali dengan aquades, kemudian diwarnai dengan safranin selama 1 menit. Selanjutnya dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Preparat siap diamati dengan mikroskop; bila berwarna violet gelap berarti termasuk dalam bakteri Gram-positif, bila berwarna oranye maka termasuk dalam bakteri Gram-negatif. 26 2. Pemeriksaan mikroskop Preparat yang sudah disiapkan pada pewarnaan Gram selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi. Dengan pengamatan mikroskopik dapat diketahui bentuk sel bakteri bulat kokus atau batang basili. 3. Pergerakan bakteri Medium yang digunakan dalam uji pergerakan bakteri adalah medium motilitas. Secara aseptis dengan menggunakan loop, suspense bakteri ditusukkan ke dalam medium motilitas yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35 o C selama 48 jam. Bila pertumbuhan bakteri menyebar, maka bakteri tersebut bergerak motil, dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak. 2 Ciri-ciri Fisiologi 1. Uji Katalase Secara aseptis diambil satu lup pertumbuhan bakteri dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian ditetesi dengan satu tetes larutan 30 H 2 O 2 . Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun. 2. Uji Oksidase Kultur bakteri ditumbuhkan pada medium Trypticase Soy Agar TSA, kemudian koloni yang terbentuk ditetesi dengan pereaksi untuk uji oksidase yaitu p-aminodimetilanilin oksalat 1 sekitar dua sampai tiga tetes. Uji positif ditandai dengan perubahan koloni menjadi merah muda, kemudian merah tua, dan akhirnya hitam. 3. Uji Indol Medium yang digunakan adalah medium Tryptone Broth. Bakteri yang diuji diionokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi Trypton Broth, dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Setelah inkubasi, masing-masing tabung 27 ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovaks. Terbentuknya cincin warna merah pada permukaan medium menunjukkan uji Indol positif. 4. Uji H 2 Medium yang digunakan pada uji H S 2 S adalah medium Sulfit Agar. Bakteri yang akan diuji diinokulasi dengan cara menusuk loop pada medium tegak Sulfit Agar yang sudah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 35 o C selama 48 jam. Terbentuknya warna hitam menunjukkan uji H 2 S positif. 5. Uji Reduksi Nitrat Bakteri diinokulasi ke dalam Nitrat Broth kemudian diinkubasi pada suhu 35 o C selama 24 jam hingga 48 jam. Kemudian tambahkan larutan α Naftilamin dan larutan asam sulfanilat masing-masing sebanyak 1 ml. Hasil uji positif bila terbentuk warna merah. Hasil uji negatif, bila tidak terjadi perubahan warna dan pengujian dilanjutkan dengan menambahkan serbuk Zink. Bila tidak terjadi perubahan warna maka hasil pengujian positif,nitrat direduksi menjadi nitrit. Bila terjadi perubahan warna menjadi merah maka hasil pengujian negatif, maka bakteri tidak mereduksi nitrat. 6. Uji Fermentasi Karbohidrat Medium yang digunakan pada pengujian ini adalah Glukosa Broth, Laktosa Broth, Fruktosa Broth, dan Sukrosa Broth. Masing-masing medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan menambahkan Brom Creso Purple BCP dan tabung Durham. Bakteri yang akan diuji secara aseptis diinokilasikan pada masing-masing medium yang telah disiapkan. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 o C selama 48 jam. Uji fermentasi positif ditandai dengan terbentuknya asam yaitu terjadi perubahan warna menjadi kuning, dan bila bakteri tersebut memproduksi gas akan ditandai dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham Fardiaz, 1992.

3.2.2 Penelitian tahap kedua

Penelitian tahap kedua adalah penetapan suhu, pH, cahaya dan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen. 28 1 Penetapan suhu optimum bagi pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen Suhu air laut berkisar antara 25 o C sampai 32 o C dengan kisaran kurang dari 2 o C Austin, 1988. Pada penelitian ini digunakan suhu inkubasi yang sesuai dengan suhu air laut yaitu 25 o C, 30 o C dan 35 o C. 1. Persiapan medium cair Komposisi medium cair yang digunakan terdiri dari pepton 5 g, ekstrak khamir 2 g, trace element 5 ml, dan NaCl 20 g. Semua bahan dilarutkan dengan 1 liter aquades, kemudian dituang ke dalam 3 labu erlenmeyer 500 ml masing- masing sebanyak 250 ml. pH awal medium diatur pada 7. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 2. Percobaan suhu bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen. a. Proses produksi pigmen Proses produksi pigmen dilakukan dalam labu erlenmeyer 500 ml yang telah diisi 250 ml medium cair. Bakteri yang telah disegarkan dalam medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian bakteri diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi untuk percobaan diatur pada 25 o C, 30 o C dan 35 o b. Isolasi pigmen C. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam. Sampel yang menghasilkan pigmen kemudian disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen ekstraseluler. Biomassa yang diperoleh diekstrak dengan metanol untuk mendapatkan pigmen intraseluser dengan cara mensentrifus pigmen pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. c. Pengukuran konsentrasi pigmen Filtrat yang diperoleh merupakan pigmen yang dihasilkan. Selanjutnya dengan menggunakan spektrofotometer, dilakukan scanning untuk mengetahui serapan maksimum bagi pigmen intraseluler maupun pigmen ekstraseluler. 29 Konsentrasi pigmen kemudian diukur pada panjang gelombang sesuai dengan hasil scanning yang diperoleh. 2 Penetapan pH optimum bagi pertumbuhan sel dan pembentukan pigmen Nilai pH air laut berkisar antara 7,5 dan 8,5 Austin, 1988. Nilai pH yang dicoba pada percobaan ini adalah 5, 7, dan 9. Nilai pH 5 juga dicoba pada penelitian ini untuk mempelajari adanya kemungkinan bakteri laut yang digunakan mengeluarkan metabolit sekunder pada pH yang ekstrim. 1. Persiapan medium cair Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk penentuan suhu optimum, tetapi medium diatur pada pH 5, 7 dan 9. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah proses sterilisasi, pH medium cair kembali diperiksa. Apabila nilai pH berubah, nilai pH dikembalikan sesuai dengan pH semula dengan menambahkan NaOH atau HCl steril. 2. Percobaan pH optimum bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen a. Proses produksi pigmen Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan sel bakteri dan pembentukan pigmen yang optimum pada percobaan 1. Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam. b. Isolasi pigmen Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu optimum. c. Pengukuran konsentrasi pigmen Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum. 30 3 Penetapan cahaya optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan pembentukan pigmen Intensitas cahaya yang digunakan pada penelitian ini adalah 2350 Wm -2 kondisi lab tanpa penambahan cahaya dari lampu, 4700 Wm -2 , dan 12500 Wm -2 . Intensitas cahaya diperoleh dengan cara mengatur jarak letak sampel pada inkubator goyang dengan lampu Philips 10 Watt dan 40 Watt. 1. Persiapan medium cair Komposisi medium cair yang digunakan sama dengan komposisi untuk penentuan suhu dan pH optimum. pH medium diatur sesuai dengan pH yang memberikan pertumbuhan yang terbaik dari percobaan 2. Setelah itu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. 2. Percobaan cahaya bagi pertumbuhan bakteri laut dan pembentukan pigmen a. Proses produksi pigmen Bakteri yang telah disegarkan pada medium padat, diambil sebanyak 2 lup dan dipindahkan ke dalam medium cair. Kemudian diinkubasikan pada inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm tanpa pengaturan aerasi. Suhu inkubasi yang digunakan adalah suhu yang menghasilkan pertumbuhan yang optimum. Intensitas cahaya yang digunakan 2350 Wm -2 , 4700 Wm -2 , dan 12500 Wm -2 b. Isolasi pigmen . Selama inkubasi dilakukan pengambilan contoh setelah kultur fermentasi berumur 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 48, 72, 96, 120, dan 144 jam. Sama dengan isolasi pigmen pada penentuan suhu dan pH optimum. c. Pengukuran konsentrasi pigmen Sama dengan pengukuran konsentrasi pigmen pada penentuan suhu optimum.

4. Penetapan salinitas optimum bagi pertumbuhan sel bakteri laut dan pembentukan pigmen