Prosedur Penelitian

D. Prosedur Penelitian

1. Identifikasi Sampel

Daun mimba diperoleh dari Klaten, Jawa Tengah. Daun mimba sebelumnya diidentifikasi di Bagian Biologi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Daun mimba yang sudah kering dihaluskan dengan blender untuk memberoleh simplisia serbuk. Kemudian serbuk daun mimnba dimaserasi dengan pelarut etanol selama 3x24 jam. Ekstrak etanol yang diperoleh selanjutnya diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 50ºC sampai diperoleh ekstrak pekat etanol.

3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol

Skrining fitokimia terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan uji tabung dan uji secara KLT. Skrining fitokimia dilakukan terhadap alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid, antrakuinon, saponin, tanin(polifenolik), dan asam lemak. Metode skrining uji tabung yang digunakan berdasarkan Pedrosa (1978), Harborne (1987), dan Sofiana (2009).

a. Alkaloid

Ekstrak diambil sebanyak 20 mg, ditambah dengan HCL 2M, dipanaskan diatas penangas air sambil diaduk, kemudian didinginkan hingga suhu ruang. NaCl serbuk ditambahkan, diaduk, dan disaring, kemudian filtrat ditambah HCl 2M sampai volume tertentu. Filtrat dibagi dalam 2 tabung reaksi, tabung 1 ditambah reagen wagner dan tabung lainnya sebagai blangko. Tabung 1 diamati terbentuknya endapan dan dibandingkan dengan larutan blangko pada tabung satunya. Jika tidak terbentuk endapan, berarti bahan tidak mengandung alkaloid dan jika terbentuk endapan berarti bahan mengandung alkaloid.

b. Flavonoid

Sebanyak 0,3 g ekstrak ditambah dengan methanol 30%, kemudian dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Larutan disaring dan filtrat ditambah dengan larutan H 2 SO 4 . Terbentuknya warna merah mengindikasikan adanya

flavonoid.

c. Terpenoid dan Steroid

0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL etanol 30%, lalu dipanaskan selama 5 menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh diuapkan. Kemudian filtrat ditambah dengan eter. Lapisan eter diambil dan ditambah dengan Liberman 0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL etanol 30%, lalu dipanaskan selama 5 menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh diuapkan. Kemudian filtrat ditambah dengan eter. Lapisan eter diambil dan ditambah dengan Liberman

d. Antrakuinon

Ekstrak ditambah 5 mL H 2 SO 4 2 N, lalu dipanaskan sebentar dan didinginkan. Kemudian ditambahkan 10 ml benzene, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzene dipisahkan dan disaring. Filtrat berwarna kuning menunjukkan adanya antrakuinon.

e. Saponin

Ekstrak diambil sebanyak 0,1 g, lalu ditambah dengan 5 mL akuades dan dipanaskan selama kurang lebih 5 menit. Kemudian larutan dikocok dan didiamkan. Jika terbentuk buih yang stabil setinggi kurang lebih 1 cm dan jika ditambah HCl buih tetap stabil maka bahan mengandung saponin.

f. Tanin(Polifenolik)

0,1 g ekstrak ditambah dengan 5 mL akuades, kemudian didihkan selama 5 menit. Larutan disaring dan filtrat yang diperoleh ditetesi dengan FeCl 3 1%. Jika terbentuk warna biru tua sampai kehitaman berarti bahan mengandung senyawa tanin(polifenolik).

g. Asam Lemak

5 mL ekstrak diuapkan sampai kering, lalu ditambahkan 5 mL KOH 0,5 N dalam etanol, direfluks sehingga tidak terlihat tetesan minyak pada permukaan cairan. Etanol dihilangkan dengan cara dipanaskan pada suhu 80ºC. sisa dilarutkan dalam air panas dan diekstraksi dengan eter 2x10 mL. Fraksi air diasamkan dengan HCl dan diekstrak lagi dengan eter. Ekstrak eter diuapkan, jika sisa berminyak maka mengandung asam lemak.

Uji KLT menggunakan plat silika gel F 254 (E. Merck). Ekstrak ditotolkan pada plat dan dielusi dengan larutan pengembang tertentu, selanjutnya disemprot dengan reagen spesifik dan bercak diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Uji KLT yang digunakan berdasarkan metode Wagner (1983) dan Harborne (1996). Uji KLT hanya dilakukan terhadap golongan senyawa yang mempunyai hasil positif terhadap uji tabung.

Larutan pengembang yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil amin (7 : 2 : 1). Plat kemudian dideteksi dengan reagen penyemprot pereaksi Dragendorrf. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Alkaloid akan memberikan warna coklat dibawah sinar tampak dan pada UV 365 nm akan memberikan warna fluorosens kuning atau biru.

b. Terpenoid dan Steroid

Larutan pengembang yang digunakan untuk analisa terpenoid dan steroid adalah heksana : etil asetat (95% : 5%). Plat kemudian dideteksi dengan reagen penyemprot SbCl 3 dalam kloroform untuk steroid dan Liberman Buchard untuk terpenoid. Terpenoid dan steroid akan memberikan warna ungu jika diamati pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm.

c. Antrakuinon

Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10). Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%. Selanjutnya plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Antrakuinon akan memberikan warna kuning pada cahaya tampak dan fluorosens kuning jika diamati pada UV 365 nm.

d. Tanin(Polifenolik)

Fase gerak yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100: 13,5 : 10). Deteksi menggunakan reagen penyemprot FeCl 3 1%. Kemudian plat

diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm.

e. Asam Lemak

Uji asam lemak menggunakan eluen benzene : dietil eter (95% : 5%). Deteksi asam lemak menggunakan reagen penyemprot 0,5 % rodamin B dalam etanol. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Asam lemak akan memberikan warna ungu pada UV 254 nm dan 365 nm.

Ekstrak etanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian menggunakan metode difusi agar yaitu metode perforasi dengan tahap kerja sebagai berikut :

a. Sterilisasi alat

Alat-alat yang akan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama kurang lebih 20 menit.

b. Pembuatan media agar miring

Sebanyak 1 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 50 mL akuades, lalu larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan menjadi kuning bening. Kemudian sebanyak 5 mL larutan NA tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi, tabung reaksi tersebut ditutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian distrelisasi pada suhu 121ºC selama 20 menit. Selanjutnya tabung reaksi diletakkan ditempat yang miring dan dibiarkan memadat pada suhu kamar.

c. Pembuatan biakan bakteri

Sebanyak 1 ose bakteri uji digoreskan pada media agar miring dengan pola zig zag. Proses ini dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi yang telah disinari dengan sinar UV. Biakan diinkubasi selama kurang lebih 18 sampai 24 jam pada suhu 37ºC.

d. Pembuatan suspensi bakteri uji

Sebanyak 1 ose bakteri dimasukkan kedaalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 3 mL akuades steril.

e. Pengujian aktivitas antibakteri

Sebanyak 3 g NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 150 mL akuades, lalu larutan tersebut dipanaskan dan distirrer diatas hotplate-stirrer sampai larutan menjadi kuning bening. larutan NA tersebut disterilisasi pada suhu 121ºC

kedalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15 mL larutan NA steril. Cawan petri digoyang supaya bakteri dan larutan NA tarcampur rata dan didiamkan sampai agar memadat. Setelah agar membeku, dibuat lubang kedalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15 mL larutan NA steril. Cawan petri digoyang supaya bakteri dan larutan NA tarcampur rata dan didiamkan sampai agar memadat. Setelah agar membeku, dibuat lubang

5. Pemisahan Ekstrak Etanol

Pemisahan ekstrak pekat etanol dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Kolom KVC yang digunakan memiliki diameter 6 cm. Sebelum dilakukan pemisahan, perlu dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Sebanyak 35 g silika Gel F 254 dimasukkan kedalam kolom KVC, silika tersebut dipadatkan dengan cara divakum dan ditekan-tekan. Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dengan aseton, lalu diimpregnasi dengan silika

adsorb G 60 sebanyak 10 g sampai tercmpur rata. Setelah homogen sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering. Proses ini diulangi sebanyak 5 kali untuk memaksimalkan hasil rendemen.

Sampel yang sudah kering selanjutnya dimasukkan kedalam kolom KVC yang sebelumnya telah diisi dengan silika Gel F 254 . Kemudian sampel dielusi dengan menggunakan pelarut heksana, etil asetat dan etanol secara berurutan. Eluen yang digunakan sebanyak 200 mL heksana, 200 mL etil asetat, dan 200 mL etanol.

Fraksi-fraksi yang diperoleh dari hasil pemisahan kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan vacum rotary evaporator dengan suhu kurang lebih 50ºC. Sehingga diperoleh fraksi pekat heksana, fraksi pekat etil asetat,dan fraksi pekat etanol.

a. Uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil KVC

Fraksi-fraksi hasil KVC dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri.

b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri

Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil sampel uji yang masih bisa menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penetapan KHM ini dilakukan dengan metode yang sama dengan pengujian aktivitas antibakteri, yaitu dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. Penetapan KHM dilakukan terhadap fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.

c. Penetapan KHM pembanding

Pembanding yang digunakan adalah amoksisilin dan kloramfenikol dengan perlakuan yang sama dengan sampel uji. Tetapi dalam pengenceran Amoksisilin digunakan buffer fosfat pH 7, sedangkan kloramfenikol menggunakan DMSO dalam pengencerannya.

7. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif Antibakteri Pengujian golongan senyawa dalam fraksi teraktif antibakteri dilakukan dengan metode yang sama dengan ekstrak etanol.

8. Kromatografi Gas-Spektrofotometer Massa (GC-MS) Analisis GC-MS dilakukan untuk mengidentifikasi komponen kimia fraksi teraktif antibakteri daun mimba. Kondisi alat GC-MS adalah sebagai berikut : Jenis pengion

: EI (Electron Impact)

Jenis kolom

: Rastex RXi-5MS

Panjang kolom

: 30 meter

Diameter kolom

: 0,25 milimeter

Suhu kolom

: 60°C

Suhu injektor

: 310°C

Penelitian ini akan dihasilkan berbagai data. Pada tahap pengujian aktivitas antibakteri ekstrak, fraksi-fraksi, amoksisilin, dan kloramfenikol akan diperoleh data diameter hambat untuk masing-masing bakteri uji pada berbagai konsentrasi tertentu. Dari uji aktivitas antibakteri ini dapat diketahui fraksi mana yang mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi terhadap bakteri uji, yaitu didasarkan dari perolehan data diameter hambat. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri paling tinggi tersebut kemudian dilakukan uji penentuan KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) dan uji banding. Selanjutnya fraksi tersebut dianalisis dengan uji tabung dan KLT (Kromatografi Lapis T ipis) dan GC-MS (Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa).

Pada penentuan konsentrasi hambat minimum diperoleh data nilai KHM. Pada uji banding potensi fraksi terhadap standar amoksisilin dan kloramfenikol diperoleh nilai potensi fraksi terhadap ketiga bakteri uji. Pada analisis KLT diperoleh golongan senyawa pada fraksi teraktif. Pada analisis GC-MS akan diperoleh data berupa kromatogram GC yang akan diperoleh informasi jumlah senyawa yang terdeteksi dan persentase komponen senyawa sedangkan dari MS akan dilakukan analisis data untuk menentuka struktur senyawa dengan membandingkan dengan data sekunder dari literatur. Data-data diameter hambat dan variasi kosentrasi hasil pengujian aktivitas antibakteri dilakukan analisa menggunakan One Way ANOVA.