folin Ciocalteau, NaOH, HCl, congo red, alkohol 70 vv, aquades, garam fisiologis, ulat jeruk Papilio memnon, isolat koleksi Bt dari tanah
naungan pohon Akasia, Bungur, Beringin, Kerai Payung, Melinjo, dan Mahoni.
C. Metode Penelitian
Uji biokimia isolat Bacillus thuringiensis yang meliputi aktivitas proteolitik dan kemampuan menggunakan karbohidrat dilakukan dengan menggunakan
Rancangan Acak Lengkap RAL 3 ulangan dan diuji lanjut dengan BNJ Beda Nyata Jujur α = 5. Uji proteolitik dilakukan secara kualitatif dengan
melihat adanya zona bening di sekitar koloni dan kuantitatif dengan menggunakan metode Bergmeyer dan Grassl 1983 yang diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Uji kemampuan menggunakan karbohidrat meliputi fermentasi laktosa, sukrosa, glukosa,
fruktosa, galaktosa dilakukan mengamati adanya gelembung dalam tabung Durham dan terbentuknya asam yang ditandai dengan perubahan warna
media menjadi kuning, dan uji hidrolisis CMC Carboxy Methyl Cellulose dilakukan dengan melihat adanya zona bening di sekitar koloni.
D. Analisis Data
Data yang diperoleh dilakukan analisis ragam. Apabila diantara perlakuan terdapat perbedaan nyata pada taraf 5, maka analisis dilanjutkan dengan
menggunakan uji lanjut BNJ Beda Nyata Jujur α = 5.
E. Prosedur Kerja
1. Identifikasi Bacillus thuringiensis Bt Berdasarkan Uji Toksisitas
Pada Ulat
Gen Cry bakteri Bt dapat bersifat toksik pada Lepidoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, Coleoptera, dan Diptera Glare, et al., 1998.
Pada uji toksisitas ini digunakan 9 isolat koleksi Bt dari laboratorium Mikrobiologi Universitas Lampung dan larva Papilio memnon. Larva
Papilio memnon tersebut dimasukkan ke dalam wadah dan diberi pakan berupa daun yang sudah diolesi isolat koleksi Bt, kemudian wadah ditutup
dan diberi lubang udara secukupnya. Uji toksisitas ini dilakukan selama 72 jam. Ulat yang terinfeksi Bt
mengalami kematian dikarenakan δ- endotoksin Bt menyerang sistem pencernaan serangga ulat dan
mengganggu keseimbangan osmotik selnya.
2. Uji Proteolitik Secara Kualitatif dan Kuantitatif
2.1. Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif
Uji proteolitik secara kualitatif isolat Bt dilakukan dengan menggunakan metode Brown, 2007 pada media Skim Milk Agar
SMA. Suspensi isolat Bt diambil sebanyak 1 ose dan di point plate ke dalam cawan petri yang berisi media Skim Milk Agar SMA, lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Aktivitas proteolitik dari
bakteri Bt yang ditumbuhkan pada media SMA ditunjukan dengan terlihatnya zona bening yang muncul di sekitar koloni Putri, 2012.
Indeks proteolitik dihitung dengan cara mengukur luas areal bening
dan luas koloni bakteri. Perhitungan indeks proteolitik adalah perbandingan luas areal bening dengan luas koloni bakteri
Baehaki, et al., 2011.
2.2. Aktivitas Enzim Protease Secara Kuantitatif
2.2.1. Pembuatan Starter Isolat Bacillus thuringiensis
Isolat Bt yang sudah diremajakan pada media Nutrient Agar miring diambil 3 ose dan diinokulasikan ke dalam erlenmeyer
250 ml yang berisi 50 ml media Nutrient Broth + Skim Milk 2 wv, kemudian diinkubasi selama 24 jam di atas shaker
incubator dengan kecepatan 120 rpm.
2.2.2. Produksi Enzim Protease
Starter Bt sebanyak 10 vv diinokulasikan ke dalam 50 ml media Nutrient Broth + Skim Milk 2 wv, kemudian
diinkubasi selama 24 jam di atas shaker incubator dengan kecepatan 120 rpm. Setelah 24 jam, kultur dimasukkan ke
dalam tabung dan dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Kemudian diambil
supernatan untuk diuji aktivitas enzim proteasenya Baehaki, et al., 2011.
