Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat Variabel Pengamatan

commit to user 8

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian tentang ”Analisis Sitologi Tanaman Buah Naga Jingga dan Kaitannya Dengan Kualitas Buah” dilaksanakan Juli 2010-Juli 2011 di Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret.

B. Bahan dan Alat

1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah a. Buah naga H. monacantus dan H. Megalanthus serta buah naga jingga. b. Acetoorcein 2, Aquades, HCl 1N, Larutan Carnoy 6 etanol: 3 kloroform: 1 Asam Asetat Glasial, gliserin, tisu, kertas label dan cat kuku. Alat pengukuran variabel pengamatan yaitu meteran, penggaris, timbangan digital, hand refractometer. 2. Alat : pot, cutter, flakon, pinset, pensil, gelas preparat, gelas penutup, oven, refrigerator, mikroskop cahaya, mikroskop foto

C. Rancangan Penelitian

1. Sitologi

Penelitian sitologi dilaksanakan dengan metode squashing pemencetan yaitu suatu metode untuk mendapatkan preparat dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan. Dengan demikian, didapat suatu preparat yang menyebar sehingga dapat diamati di bawah mikroskop. Mempelajari sitogenetika terkait dengan pembelahan sel. Pembelahan sel terdiri dari pembelahan mitosis dan meiosis. Pemebelahan mitosis merupakan pembelahan duplikasi dimana sel mereproduksi dirinya sendiri dengan jumlah kromosom sel anak sama dengan jumlah kromosom sel commit to user 9 induk. Fase-fase dalam pemebelahan mitosis menurut Suryo 1984, adalah; 1. Interfase, yaitu sel belum memperlihatkan kegiatan membelah, inti sel tampak keruh, dan mulai tampak benang-benang kromatin yang halus. 2. Profase, yaitu benang-benang kromatin makin pendek dan tebal sehingga terbentuk kromosom, tiap kromosom lalu membelah, memanjang dan anakan kromosom disebut kromatid, kemudian dinding sel mulai menghilang dan sentriol membelah. 3. Metafase, yaitu semua kromosom sepasang kromatid bergerk menempatkan diri pada bidang ekuatorial dan menggantung pada serat gelendong lewat sentromernya serta dinding inti sel telah menghilang. 4. Anafase, yaitu sentriol membelah dan kedua kromatid memisahkan diri dan bergerak menuju kutub sel yang berlawanan. 5. Telofase, yaitu dari setiap kutub sel terbentuk set kromosom yang identik, serabut gelendong inti lenyap dan dinding inti terbentuk lagi. Kemudian plasma sel membelah menjadi dua bagian yang disebut sitokinese. Sitokinese pada tumbuhan ditandai dengan terbentuknya dinding pemisah di tengah-tengah sel. Cara kerja penelitian ini : a. Pengambilan bahan Pengambilan bahan dilakukan dengan memotong bagian akar yang meristematis sepanjang ± 5 mm dari ujung akar. Akar yang dipilih adalah akar yang berwarna putih, lunak dan terletak di bagian batang, sebenarnya akar yang di dalam tanah juga dapat digunakan, tetapi karena akar bawah terlalu kecil sehingga setelah mengalami beberapa perlakuan akar menjadi kering dan saat pemencetan akar tidak mau menjadi pipih serta menyebar. Ujung akar yang sudah dipotong kemudian dicuci dengan air bersih. Pemotongan ujung akar dilakukan pada pagi hari, mulai pukul 06.30-08.00 WIB. Setiap tumbuhan memiliki waktu optimum pembelahan mitosis yang khas tergantung jenisnya Johansen, 1940 dan commit to user 10 Oktaviana, 2008. Mengacu pada Setyawan dan Sutikno cit Oktaviana 2008 pemotongan akar dilakukan pada pagi hari karena tumbuhan umumnya memiliki waktu optimum pembelahan mitosis pada pagi hari. Pembuatan sediaan dapat dilakukan dengan menggunakan ujung akar, ujung batang, primordial daun, petala, ovulum muda dan kalus. Namun, yang biasa digunakan adalah ujung akar karena mudah tumbuh dan seragam Darnaedi, 1991 cit Setyawan dan Sutikno, 2000. Selain itu, Parjanto et al 2003 dalam penelitiannya tentang kariotipe salak, menggunakan ujung akar yang aktif tumbuh sebagai bahan pembuatan sediaan untuk pengamatan kromosom. Penggunaan ujung akar memiliki keunggulan dibanding bahan lain dari tumbuhan karena pada saat pengamatan kromosom tidak akan terganggu dengan adanya kloroplas atau organel lain dalam sel tumbuhan. b. Pra perlakuan Untuk mempermudah proses pengamatan jumlah dan morfologi kromosom dapat dilakukan pra perlakuan, yaitu dengan perusakn viskositas antara isi spindle dan sitoplasma sehingga ikatan kromosom akan longgar dan dapat menyebar dengan baik saat dilakukan pengamatan. Pra perlakuan dapat dilakukan dengan menggunakan aquades maupun zat kimia, tetapi aquades lebih sering digunakan pada jaringan hewani sedangkan zat kimia pada dasarnya dapat digunakan untuk jaringan tanaman. Zat kimia yang biasa digunakan diantaranya, kolkhisin, acenaphthene, caumarin dan lain-lain Gunarso, 1988. Kegiatan pra perlakuan dilakukan dengan memasukkan ujung akar yang telah dipotong ke dalam flakon yang berisi aquadest selama ± 4 jam pada suhu ruang. c. Fiksasi Fiksasi dilakukan dengan merendam bahan ke dalam larutan carnoy dan disimpan dalam refrigerator pada suhu 5 o C selama ± 3 jam. Bahan yang telah selesai difiksasi, selanjutnya dicuci dengan alkohol commit to user 11 70, 50, dan 30 secara berturut – turut dan kemudian dicuci kembali aquadest sebanyak 3 kali. Fiksasi merupakn suatu usaha untuk mempertahankan elemen- elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempat dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Oleh karena itu fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa, sehingga perubahan bentuk atau struktur seljaringan yang terjadi hanya sekecil mungkin Suntoro, 1983. Pencucian menggunakan aquades setiap kali adanya perlakuan berfungsi untuk menghilangkan pengaruh perlakuan sebelumnya dan mengembalikan bahan pada suhu kamar sebelum diberi perlakuan yang selanjutnya Setyawan dan Sutikno, 2000 d. Hidrolisis Hidrolisis dilakukan dengan merendam bahan ke dalam larutan HCL 1 N dan disimpan dalam oven bersuhu 60 o C selama ± 5 menit. Setelah selesai, bahan dicuci dengan aquadest sebanyak 3 kali. Hidrolisis berfungsi untuk melarutkan lamela tengah, sehingga sel dapat dipisah-pisahkan hingga ketebalannya selapis sel. Hidrolisis dapat menggunakan asam atau enzim hidrolase. Salah satu asam yang biasa digunakan adalah asam klorida. Asam klorida memiliki kemampuan yang cukup tinggi untuk melarutkan lamela tengah. Konsentrasi 1 N merupakan konsentrasi yang optimum. Pada konsentrasi lebih rendah daya kerjanya kurang, sehingga harus direndam lebih lama, sedangkan pada konsentrasi lebih tinggi dapat menguraikan nukleus beserta kromosom di dalamnya sehingga inti berbentuk memanjang dan kromosom tidak dapat diamati secara sempurna. Kecepatan reaksi asam klorida meningkat sejalan dengan kenaikan suhu. Suhu tertinggi yang masih diperkenankan dalam prosedur ini adalah 60 o C. Penggunaan asam terlalu lama dapat mengurangi afinitas pewarna terhadap kromosom Setyawan dan Sutikno, 2000. commit to user 12 e. Pewarnaan Pewarnaan dilakukan dengan merendam bahan ke dalam larutan aceto orcein 2 dan disimpan dalam refrigerator pada suhu 5 o C selama ± 24 jam. Orcein merupakan pemberi warna merah ungu yang dipersiapkan dengan mereaksikan hidrogen peroksida dan ammonia pada subtansi- subtansi orcinol ataupun orcin yang tidak berwarna Gunarso, 1988. Aseto orcein sangat cocok untuk ujung akar karena penetrasinya cepat serta tahan lama Setyawan dan Sutikno, 2000. f. Squashing pemencetan Squashing dilakukan dengan mengambil bagian potongan ujung akar meristematis sepanjang ± 0,5 mm dari ujung akar dan diletakkan di atas gelas preparat. Selanjutnya ditetesi dengan larutan asam asetat 45 dan ditutup dengan gelas penutup kemudian dipencet squash dengan ibu jari atau dengan menggunakan pensil yang diketuk-ketukkan secara perlahan, kemudian preparat hasil pemencetan disegel dengan menggunakan cat kuku bening. Metode pencet atau metode squash adalah suatu metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organisme secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis yang dapat diamati di bawah mikroskop Suntoro, 1983. Kualitas squash sangat menentukan kualitas preparat. Squash yang baik menghasilkan preparat yang hanya terdiri dari selapis sel, terpisah- pisah, tidak tumpang tindih, tidak terpecah-pecah dan tidak terdenaturasi. Squash dilakukan dengan media gliserin. Gliserin bersifat kental dan licin, sehingga memudahkan proses squash serta sulit menguap sehingga mampu menjaga kesegaran bahan Setyawan dan Sutikno, 2000 g. Pengamatan: pengamatan menggunakan mikroskop cahaya. Untuk memperbaiki daya resolusi dapat menggunakan minyak emersi commit to user 13 Anggarwulan et al, 1999 cit Marfu’ah, 2007. Kromosom tahap profase atau metafase awal yang menunjukkan penyebaran kromosom dengan baik dipotret dengan mikroskop foto Nikon dan dibuat mikrografinya. Selanjutnya hasil cetak gambar kromosom tersebut digunakan untuk pengamatan jumlah dan morfologi kromosom. Metode ini merupakan modifikasi metode yang dipergunakan oleh Marfu’ah 2007.

2. Kualitas Buah

Penelitian kualitas buah meliputi uji kadar gula buah, bentuk buah, warna kulit, warna daging buah, berat buah. Dari variable tersebut, mencoba membandingkan buah naga jingga dengan H. monacantus dan H. megalanthus yang diduga induk dari buah naga jingga.

D. Variabel Pengamatan

Morfologi kromosom yang diamati adalah: a. Jumlah kromosom Kromosom yang tampak pada mikroskop dipotret dan dari hasil cetakan dapat dihitung jumlah kromosomnya dalam satu sel.Perbedaan kromosom secara umum menggambarkan perbedaan kandungan genetik dan protein suatu individu. Variasi utama yang dapat diamati yaitu ukuran atau panjang absolut, morfologi, ukuran relatif dan jumlah kromosom. Individu-individu dalam satu spesies mempunyai jumlah kromosom sama, tetapi spesies yang berbeda dalam satu genus mempunyai jumlah kromosom yang berbeda. Bentuk, ukuran, dan jumlah kromosom setiap spesies selalu tetap, sehingga dapat digunakan untuk tujuan taksonomi, mengetahui keragaman, hubungan kekerabatan dan evolusi meskipun dalam keadaan tertentu pula terjadi variasi Suliartini et al. , 2004. commit to user 14 b. Ukuran dan bentuk kromosom Ukuran kromosom yang diamati adalah panjang kromosom. Panjang kromosom diukur menggunakan objek mikrometer, meliputi panjang lengan panjang q, panjang lengan pendek p, dan panjang total, yaitu hasil penjumlahan panjang lengan panjang dan panjang lengan pendek q+p. Pengamatan bentuk kromosom juga meliputi pengamatan terhadap ada atau tidaknya satelit kromosom. Satelit kromosom ditunjukkan dengan adanya lekukan ke dalam seperti sentromer tetapi berada di dekat bagian ujung kromosom. Bentuk kromosom ditentukan berdasarkan rasio panjang lengan panjang dan lengan pendek ÷ ø ö ç è æ = p q r . Penentuan bentuk kromosom mengacu pada cara Ciupercescu et al . 1990 cit . Parjanto et al . 2003 yang dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 3.1 Bentuk Kromosom Berdasarkan Rasio Lengan Kromosom Bentuk kromosom Rasio lengan Metasentrik m Submetasentrik sm Akrosentrik t Telosentrik T 1,0 r ≤ 1,7 1,7 r ≤ 3,0 3,0 r ≤ 7,0 ≥ 7,0 c. Kariotipe kromosom Penyusunan kariotipe kromosom buah naga jingga dinyatakan dalam bentuk karyogram dan idiogram. Karyogram merupakan penyusunan kromosom secara berurutan dari ukuran terpanjang sampai terpendek dan memasangkan masing-masing kromosom pada kromosom homolognya, sedangkan idiogram disusun dengan menyatukan pasangan kromosom berdasarkan rata-rata panjang total dan bentuk kromosom. Selanjutnya rumus kariotipe kromosom buah naga jingga dapat ditentukan. commit to user 15 Kualitas buah yang diamati adalah : a. Berat buah Pengamatan dilakukan dengan cara menimbang buah yang diamati menggunakan timbangan. b. Bentuk buah. Diamati dengan mengukur panjang dan diameter dari buah yang berhasil terbentuk. Bentuk buah diklasifikasikan berdasarkan Tjitrosoepomo 1989 dan ditentukan dengan membandingkan panjang dengan diameter buah yaitu : o Bulat bundar jika perbandingan panjang : diameter = 1:1 o Ovalis jorong jika perbandingan panjang : diameter 1,5-2 :1 o Memanjang oblongus jika perbandingan panjang : diameter 2,5- 3: 1 o Lanset jika perbandingan panjang : diameter 3-5 : 1 c. Warna kulit buah, pengamatan dilakukan dengan mengamati secara seksama warna kulit buah. d. Warna daging buah, pengamatan dilakukan dengan mengamati secara seksama warna daging buah. e. Kadar gula buah diukur secara langsung dengan menggunakan alat Hand Refractometer . Bagian yang diamati adalah sari buah dari daging buah naga. Sari buah diambil dengan cara menghancurkan daging buah naga hingga terdapat bagian yang berupa air yang disebut sari buah. Sari buah diletakkan pada hand refractometer untuk diukur kadar gulanya. commit to user

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Penampilan fenotip suatu tanaman dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan faktor genetik serta interaksi antara keduanya. Deskripsi berdasarkan analisis sitologi diharapkan dapat memberikan informasi yang akurat mengenai sifat genetik suatu tanman sehingga akan mempermudah pelaksanaan program pemuliaan tanaman. Bagian terkecil dari makhluk hidup dinamakan sel, inti sel atau nukleus terdiri dari : selaput karyotheca, plasma karyoplasma atau nukleuplasma, anak inti nukleolus dan kromosom. Kromosom adalah pembawa bahan keturunan yang mengandung gen-gen dan merupakan sarana bagi pemindahan gen bahan keturunan atau materi genetik yang mengatur penampilan sifat-sifat keturunan dari generasi ke generasi berikutnya pada organisme. Kromosom merupakan jalinan benang-benang halus yang berpilin-pilin longgar dan diselimuti protein disebut kromonema dalam plsma inti yang mudah mengikat zat warna. Selama sel membelah, pilinan tersebut menjadi sangat rapat sehingga memendek dan membesar sehingga dapat diamati dengan jelas bagian-bagiannya di bawah mikroskop Yatim, 1986. Menurut Apandi 1992, kariotipe merupakan gambaran dari semua kromosom aktual yang ditemukan dalam sebuah sel. Kariotipe selalu diperlihatkan dengan kromosom-kromosom yang menjadi dua, sebab kita bisa memberi gambaran mengenai kromosom-kromosom hanya setelah kromosom itu menjadi dua dan melingkar pada pembelahan sel. Pengamatan kromosom dapat dilakukan pada saat sel membelah. Pembelahan sel dibedakan atas pembelahan mitosis dan pembelahan meiosis. Pembelahan mitosis meliputi beberapa fase membelah sebagaimana diuraikan berikut ini: Interfase, pada fase in sel belum mempertlihatkan kegiatan membelah, inti sel tampak keruh, mulai tampak benang-benag kromatin yang halus. Profase, fase yang ditunjukan dengan benang-benang kromatin yang semakin pendek dan tebal sehingga