Idris Maliki, 2015 IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia |
repository.upi.edu |
perpustakaan.upi.edu
PCR dengan elektroforesis gel agarosa, sekuensing urutan nukleotida daerah HV2 manusia dengan metode dideoksi sanger, dan analisis urutan nukleotida hasil
sekuensing dengan menggunakan program SeqMan ver 4.00 DNASTAR. Secara keseluruhan penelitian dapat digambarkan seperti bagan alir pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian
3.3.1. Pengumpulan Sampel
Sampel yang digunakan adalah akar rambut dari empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2. Pengambilan sampel akar rambut dengan cara
mencabut rambut sampai akarnya, sehingga didapatkan akar rambut yang selanjutnya digunakan pada tahap lisis dan ekstraksi mtDNA dari akar rambut
tersebut.
Idris Maliki, 2015 IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia |
repository.upi.edu |
perpustakaan.upi.edu
3.3.2. Isolasi mtDNA
Sampel akar rambut diisolasi secara enzimatik. Tahap awal sampel rambut sebanyak 5-7 helai dipotong ±1 cm dari bagian pangkal akarnya dan dimasukan
ke dalam tabung eppendorf ukuran 1500µ L yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf. Kemudian ditambahkan ddH
2
O sebanyak 170µL. Selanjutnya ditambahkan 20 µL buffer lisis 500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8,
dan 5 Tween-20, dan 10µL enzim proteinase K 10mgmL hingga volume lisis tepat 200 µL. Kemudian tabung eppendorf yang berisis campuran reaksi
dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi selama 1 jam pada waterbath pada suhu ±55C°. Setelah itu dilakukan proses deaktifasi enzim proteinase K pada suhu
±95C° selama 10 menit. Kemudian campuran reaksi disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah proses sentrifugasi supernatan diambil
sebanyak 150 µL untuk selanjutnya digunakan sebagai templat pada proses PCR.
3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In Vitro dengan Teknik PCR
Proses amplifikasi fragmen daerah HV2 mtDNA manusia dilakukan dengan menggunakan primer HV2R dan HV2F. Campuran reaksi PCR dimasukan
kedalam tabung eppendorf 200µL, terdiri dari 5 µL templat mtDNA hasil lisis; 0,5 µL primer HV2F 20 pmolµL; 0,5 µL primer HV2R 20 pmolµ L; 2,5 µL
Buffer PCR 10x 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1 triton X-100, 15 mM MgCl
2
; 0,2 µL enzim taq DNA polimerase 5 unitµL; 0,5 µL campuran dNTP 10 mM; dan 15,8 µL ddH
2
0 sehingga volumenya mencapai 25 µL. Urutan nukleotida, ukuran, posisi dan suhu penempelan primer HV2F dan
HV2R ditunjukan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer HV2F dan HV2R Primer
Urutan 5 ’ ke 3’
Posisi Ukuran
Suhu Penempelan
HV2F GGT CTA TCA CCC
TAT TAA CCA C L 8-29
22 Nukleotida
52,2°C
Idris Maliki, 2015 IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA
EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia |
repository.upi.edu |
perpustakaan.upi.edu
HV2R CTG TTA AAA GTG
CAT ACC GCC H 429 - 409
21 Nukleotida
54,4°C
Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp® PCR System 2700 sebanyak 35 siklus. Tahap pertama dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal
yang dilakukan pada suhu 90°C selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR yang terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi yang dilakukan pada
suhu 94°C selama 1 menit, tahap annealing yang dilakukan pada suhu 50°C selama 1 menit, dan tahap polimerisasi yang dilakukan pada suhu 72°C selama 4
menit. mtDNA hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20°C.
3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
