BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1.
Desain Penelitian
Penelitian dilakukan secara cross sectional study potong lintang .
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara RSUP Haji Adam Malik Medan
bekerjasama dengan Departemen Penyakit Dalam, pada Divisi Gastroentero- Hepatologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Penelitian dilakukan pada bulan September 2010 sampai dengan Desember 2010. Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai
atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.
3.3. Populasi dan Subjek Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian
Populasi penelitian adalah pasien yang menderita dyspepsia yang rawat jalan dan rawat inap dan sebagai kelompok kontrol adalah pasien yang
tidak menderita dispepsia tipe tukak pada Penyakit Dalam FK USU RSUP H. Adam Malik Medan dengan usia diatas 40 tahun bekerjasama dengan
Departemen Penyakit Dalam, pada Divisi Gastroentero-Hepatologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2. Subjek Penelitian
Subjek yang diikutkan dalam penelitian adalah semua penderita Dispepsia dan memenuhi kriteria sebagai berikut :
3.3.3. Kriteria Inklusi
1. Bersedia ikut dalam penelitian. 2. Dyspepsia tipe tukak, berdasarkan hasil dari endoskopi.
3.3.4. Kriteri Eksklusi
1. Dyspepsia yang non tukak.
3.4. Perkiraan Besar Sampel
Sampel dipilih secara consecutive sampling dengan perkiraan besar sample minimum dari subjek yang diteliti dipakai rumus uji hipotesis rerata
dua kelompok independent
41
:
Dimana: n1 = jumlah sampel, n2 = jumlah kontrol
Z α = nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilai α
yang ditentukan. Untuk α = 0,05 → Zα = 1,96.
Z β = nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilai β
yang ditentukan . untuk β = 0,15 → Zβ = 1,036.
P1 = proporsi Helicobacter = 16,91 = 17 = 0,17 Q1 = 1 – P1 = 1 – 0,17 = 0,83
P2 = proporsi Helicobacter pada orang normal = 0 Q2 = 1 – P2 = 1 – 0 = 1
Universitas Sumatera Utara
= 0,085
Q = 1 – P = 0,915 Jumlah sampel yang diperlukan : 41,87
≈
42
3.5. Analisa Data
Untuk melihat hasil dari pemeriksaan serologi dan disajikan dalam bentuk tabulasi dan didiskripsikan. Untuk melihat hubungan pemeriksaan
serologi antibodi Helicobacter pylori terhadap penderita dispepsia digunakan Uji T Independen, jika data kedua kelompok berdistribusi normal. Sebaliknya
digunakan Uji Mann Whitney untuk data yang berdistribusi tidak normal. Taraf signifikansi
α = 0,05
3.6. Bahan dan Cara Kerja 3.6.1. Pengambilan Sampel
Sampel darah diambil dari vena mediana cubiti. Tempat punksi vena terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering,
kemudian dilakukan punksi. Pengambilan darah dilakukan dengan menggunakan spuit disposibel sebanyak 5 cc dan darah dipisahkan dari
serum dengan cara sentrifuge 3000rpm selama 15 menit. Spesimen dibekukan sampai 3 bulan dengan suhu -20 ºC.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2. Pemeriksaan Serologi IgG Helicobacter pylori
37,38,39,40
Tujuan : Untuk mengetahui serologi dari infeksi Helicobacter pylori dalam
serum pada penderita gangguan pencernaan Metode
: ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay Prinsip
: Bersihan dari antigen Helicobacter pylori melapisi permukaan dari microwell. Assay serum pasien yang diencerkan
ditambahkan kedalam sumur yang telah dilapisi antigen yang dimurnikan. Jika terdapat IgG spesifik antibody, akan melekat ke
antigen. Untuk menghilangkan semua material yang tidak melekat dicuci, dan ditambahkan enzym konjugat untuk
mengikat antibody antigen komplek. Antigen konjugat yang berlebih dicuci dan ditambahkan substrat. Inkubasi plate
memberikan reaksi hydrolisis dari substrat oleh enzym ini. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan jumlah atau
banyaknya dan IgG spesifik antibody dalam sampel.
3.6.3. Cara kerja :
- Letakkan strip yang telah bernomor pada tempatnya - Kontrol negatif, kontrol positif dan kalibrator siap untuk dikerjakan.
Pengenceran 1:40 dari sampel sebagai persiapan, yaitu sampel sebanyak 5
μL ditambahkan diluent sebanyak 195 μL. Campur
hingga rata.
Universitas Sumatera Utara
- Tambahkan 100
μL diluted sera, kalibrator dan kontrol kedalam sumur yang telah ditentukan. Untuk blank reagen,
tambahkan 100 μL sampel diluent pada posisi sumur 1A. Buka
penutup agar gelembung udara keluar dan campur dengan baik. Inkubasi selama 30 menit pada temperatur ruangan. Keluarkan
semua dari dalam sumur, cuci sebanyak 5 kali dengan 300 μL wash
buffer. Keringkan dengan kertas absorban atau handuk kertas. -
Tambahkan 100 μL enzyme konjugate pada setiap sumur dan
inkubasi 30 menit suhu ruangan -
Keluarkan enzyme konjugate dari sumur, cuci dengan wash buffer 300
μL sampai 5 kali. Keringkan dengan kertas absorban atau handuk kertas.
- Tambahkan 100
μL TMB substrat dan inkubasi 20 menit suhu ruangan. Tambahkan 100
μL stop solution untuk menghentikan reaksi.
- Baca pada panjang gelombang 450nm menggunakan Elisa
reader. -
Reagen yang digunakan berasal dari Indec Reagen.
3.6.5. Cara Perhitungan
- Hitung rata-rata nilai kalibrator X
c
- Hitung rata-rata dari kontrol positif, kontrol negatif, sampel
- Hitung index IgG Helicobacter pylori yaitu dengan membagi nilai
rata-rata dari setiap sampel dengan rata- rata nilai kalibrator X
c
Universitas Sumatera Utara
3.6.4. INTERPRETASI -
Negatif : Index Helicobacter pylori IgG 0,90 atau kurang adalah seronegatif dari IgG antibodi Helicobacter
pylori. .
- Equivocal : Index Helicobacter pylori IgG 0,91-0,99. Dilakukan
pemeriksaan ulang dengan sampel serum yang baru 3 minggu kemudian.
- Positif : Index Helicobacter pylori IgG adalah 1,00 atau
lebih besar adalah seropositif. - Pemeriksaan darah rutin menggunakan alat Sysmex 2100
3.7. PEMANTAPAN KUALITAS
Pemantapan kualitas laboratorium yang baik harus dilakukan untuk mendapatkan hasil pemeriksaan laboratorium yang benar. Kontrol positif dan
kontrol negatif harus dilakukan secara paralel dengan spesimen yang berasal dari pasien. Kegagalan untuk mendapatkan hasil yang tepat untuk nilai
kontrol mengindikasikan kemungkinan kesalahan baik dari reagen yang digunakan atau tehnisi yang melakukan pemeriksaan. Pemeriksaan yang
dilakukan valid berdasarkan kriteria: 1. Nilai Optical density OD blank reagen terhadap udara dari
mikrowell reader kurang dari 0,250
Universitas Sumatera Utara
2. Jika nilai OD dari Cut-off kalibrator lebih rendah dari 0,250 pemeriksaan tidak valid dan harus diulang
3. Nilai cut-off ditentukan dengan cara yaitu: Mean Negatif Kalibrator + 0,1x Mean Positif Kalibrator.
4. Nilai cut off kalibrator 1,0, nilai kontrol negatif adalah 0,5, sedangkan nilai kontrol positif adalah 1-3
5. Nilai OD pada blank reagen dari pada penelitian ini tetap 0,250 stiap dilakukan pemeriksaan.
6. Penelitian ini dilakukan selama 3 hari dengan jumlah sampel sebanyak 62; kelompok sampel 31 orang, kelompok kontrol 31
orang.
Hari Sampel + hasil
Kontrol + hasil Hari 1
15 sampel; + 1 orang Hari 2
16 sampel; + 7 orang Hari 3
31 kontrol; seluruh hasil Negatif
Universitas Sumatera Utara
3.8. Ethical clearance dan informed consent
Kategori