d. Perhitungan Indeks Eritrosit
1 Mean Corpuscular Volume MCV
MCV fl = PCV x 10
Jumlah eritrosit per μl darah X 10
−6
2 Mean Corpuscular Hemoglobin MCH
MCH pg
=
Hb x 10 PCV
3 Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration MCHC
MCHC =
Hb x 100 PCV
7. Perhitungan Leukosit dan Diferensiasi Leukosit
Pengamatan leukosit juga dilakukan terhadap diferensiasinnya. Perhitungan diferensiasi leukosit secara manual dilakukan dengan pemeriksaan
preparat ulas darah. Sedian preparat ulas darah yang sudah dikeringkan di udara, dimasukan dalam metal alkohol selama 5 menit. Kemudian diangkat,
dikeringkan, lalu dimasukkan ke dalam larutan Giemsa selama 30 menit. Preparat tersebut selanjutnya diangkat dan dicuci dengan menggunakan air
keran yang mengalir. Kemudian preparat tersebut dikeringkan di udara, lalu dilakukan pemeriksaan menggunakan mikroskop cahaya. Setiap leukosit yang
ditemukan dideferensiasikan ke dalam heterofil, limfosit, monosit, eosinofil dan basofil dalam persentase kemudian dihitung totalnya dengan cara:
Total diferensiasi leukosit butirmm
3
= persentase diferensiasi leukosit x jumlah total leukosit
8. Indeks Stres
Indeks stres merupakan indikator stres pada unggas yang dapat diukur dengan rasio HL Sarica et al. 2015.
9. Analisa Kadar Malondiadialdehid MDA dan SOD Superoksidasi
Dismutase Hati Puyuh
Puyuh dikorbankan pada hari ke 35 dengan cara eutanasi untuk diambil organ hati dan dianalisa kadar MDA dan SOD.
a. Analisa Kadar Malondiadialdehid MDA
Analisa kadar MDA hati puyuh dilakukan berdasarkan metode yang digunakan Conti et al. 1991.
1 Persiapan larutan standar
Larutan kerja 10 µM dibuat dengan mengencerkan stok standar 2.5 mM 1.1.3.3-tetraetoksipropana TEP. TEP 1.1.3.3-tetraetoksipropana
digunakan sebagai larutan standar. Kurva standar dibuat dengan mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa kosentrasi yaitu 500, 1000,
2000, 3000, 4000 dan 5000 pmol50 µL. 2
Pengukuran kadar MDA Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks
berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat TBA. Hati yang telah disimpan dalam freezer -20
○
C dibiarkan mencair terlebih dahulu sebelum
dianalisis pada suhu ruang. Hati digerus dengan menggunakan lumpang digerus dalam keadaan dingin, dengan ditambahkan 1.25 mL buffer fosfat
yang mengandung 11.5 gL kalium klorida dalam kondisi dingin pH 7.4 disimpan pada suhu 5
○
C. Campuran ini disentrifus 4000 rpm selama 10 menit, diambil supernatan keruh dan disentrifus lagi 4000 rpm selama 10
menit, sebanyak 1 mL supernatan jernih diambil dan ditambahkan 1 mL campuran larutan asam klorida dingin 0.25 N 2.23 mL asam klorida100 mL
yang mengandung 15 asam trikloroasetat wv; 0.38 asam tiobarbiturat dan 0.5 butilat hidroksitoleun. Campuran larutan asam klorida dan
supernatan tersebut dipanaskan 80
○
C inkubator selama 1 jam, selanjutnya didinginkan dengan air mengalir dan disentrifus 3500 rpm selama 10 menit.
Supernatan hasil sentrifus tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm.
MDA µmolg protein = A µmolg x 3.75 mL0.6 g bb Ket: A = Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva standar.
b. Pengukuran Aktivitas Enzim SOD Superoksidasi Dismutase Hati
Pengukuran aktivitas enzim SOD hati puyuh dilakukan berdasarkan
metode yang digunakan Chen et al. 1995. 1
Persiapan larutan standar Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD Sigma, USA murni
sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan, yaitu 0, 50, 100, 200, 250, 300 dan 500 unitmL H
2
O dan larutan ini digunakan untuk membuat kurva standar.
2 Pengukuran aktivitas SOD
Pengukuran aktivitas enzim SOD Superoksidasi dismutase, ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung, dengan
menggunakan spektrofotometer. Pengukuran enzim ini dipakai sistem xantinxantin XO yang menghasilkan anion superoksida O
2 -
yang mereduksi ferrisitokrom c.
Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh xantinxantin
oksidase. Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi
pada panjang gelombang 550 nm. Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25
○
C, larutan oksidase harus tetap dalam keadaan dingin didinginkan selama 15 menit sebelum digunakan. Medium reaksi segera
dipersiapkan sebelum pengukuran dengan memasukkan 2.9 mL larutan A campuran larutan xantin dan larutan sitokrom c ke dalam tabung reaksi 3 mL.
Selanjutnya ditambahkan 50 µL larutan beku kontrol atau sampel lalu divorteks secara perlahan. Reaksi dimulai dengan larutan B xantin oksidase
dan divorteks secara perlahan. Kemudian diamati perubahan absorbansi yang terjadi pada spektrofotometer. Blanko digunakan buffer fosfat sebagai
pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi. Untuk mengembalikkan ke kosentrasi awal yaitu dalam gr maka dikonversi dengan
rumus:
SOD Ug = A µmolmL x 0.67 mL0.5 g bb Ket: A = Kadar SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva standar.