Alat- alat Bahan-bahan Sterilisasi Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak

19

BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental parametrik. Parameter yang digunakan mengacu pada Materia Medika Indonesia. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan pencadang kertas. Parameter yang diukur adalah besarnya zona hambat di sekitar pencadang kertas. Tahapan-tahapan penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, skrining fitokimia, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pembuatan ekstrak etanol sawi tanah dengan cara maserasi kemudian difraksinasi berturut-turut dengan pelarut n-heksana dan etilasetat. Pengujian aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Shigella dysenteriae. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USU Medan dan Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi USU Medan pada bulan September 2014 – Desember 2014.

3.1 Alat- alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil, alat tanur, autoklaf Fisons, blender Philips, cakram kertas, cawan petri, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kaca objek, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF I200L, lampu bunsen, lemari pendingin Toshiba, lemari pengering, mikro pipet Eppendorf, neraca analitik Mettler Toledo, neraca kasar Ohanus, oven Memmert, pinset, rotary evaporator Haake D dan spektrofotometer visibel Dynamica Halo Vis-10. Universitas Sumatera Utara 20

3.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air suling, etanol, herba sawi tanah Adenostemma lavenia L. Kuntze, nutrient agar, nutrient broth dan bahan-bahan yang be rkualitas proanalisa E.Merck: α-naftol, amil alkohol, asam nitrat pekat, asam asetat anhidrat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, benzena, besi III klorida, bismuth nitrat, dimetilsulfoksida DMSO, etilasetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, n-heksana, raksa II klorida, serbuk magnesium, timbal II asetat dan toluena. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 dan Shigella dysenteriae ATCC 12022. 3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.3.1 Pembuatan larutan pereaksi

3.3.1.1 Pereaksi Meyer

Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml dan pada wadah lain dilarutkan 50 g kalium iodida dalam 100 ml air suling. 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.1.2 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.

3.3.1.3 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida dan 2 g iodium dilarutkan dalam air suling secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 21

3.3.1.4 Pereaksi Dragendorff

Pereaksi dibuat dua larutan persediaan : 1 0,6 g bismut nitrat dalam 2 ml HCl pekat dan 10 ml air; 2 6 g kalium iodida dalam 10 ml air. Larutan persediaan ini dicampur dengan 7 ml HCl pekat dan 15 ml air Harborne, 1987.

3.3.1.5 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml, lalu disaring Ditjen POM, 1979. 3.3.1.6 Pereaksi asam klorida 2 N Asam klorida pekat sebanyak 16,6 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.

3.3.1.7 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes RI , 1995.

3.3.1.8 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 10 tetes asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 tetes asam sulfat pekat. Ditambahkan dengan hati-hati asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut, didinginkan Depkes RI, 1995.

3.3.1.9 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.3.1.10 Pereaksi kloralhidrat

Pereaksi kloralhidrat dibuat dengan cara melarutkan kloralhidrat sebanyak 50 g dalam 20 ml air Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 22 3.3.2 Pembuatan Media 3.3.2.1 Media nutrient agar Komposisi : Bacto beef extract 3,0 g Bacto peptone 5,0 g Bacto agar 15,0 g Cara pembuatan: Sebanyak 23 g nutrient agar ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna lalu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Difco, 2009.

3.3.2.2 Media nutrient broth

Komposisi : Peptone 5,0 g Beef extract 3,0 g Air suling ad 1 L Cara pembuatan: Sebanyak 13 gram serbuk nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril sedikit demi sedikit kemudian volumenya dicukupkan hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Difco, 2009.

3.3.2.3 Pembuatan agar miring

Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30 o -45 o dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994. Universitas Sumatera Utara 23

3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit dan alat- alat gelas disterilkan di oven pada suhu 160-170 o C selama 1-2 jam. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan cara dibakar dengan nyala bunsen Lay, 1994. 3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengumpulan bahan tumbuhan Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah seluruh bagian tumbuhan sawi tanah. Bahan diambil dari Namo rambe, Kelurahan Tangkahan, Kabupaten Deli Serdang, Provinsi Sumatera Utara.

3.5.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian - Biologi LIPI Bogor. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 47.

3.5.3 Pembuatan simplisia

Herba sawi tanah dicuci bersih dari pengotoran dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Kemudian dikeringkan di lemari pengering dengan suhu 40 o - 50 o C. Herba sawi tanah dianggap kering apabila sudah rapuh diremas menjadi hancur, kemudian simplisia herba sawi tanah yang telah kering diserbuk menggunakan blender, dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat. Gambar simplisia dan serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 48-49. Universitas Sumatera Utara 24 3.6 Karakterisasi Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia herba sawi tanah dengan mengamati bentuk, bau, rasa dan warna.

3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia herba sawi tanah. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop hasil dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 51.

3.6.3 Penetapan kadar air

a. Penjenuhan toluen Sebanyak 200 ml toluen dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling, kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,1 ml. b. Penetapan kadar air simplisia Labu berisi toluen tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik dan setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,1 ml. Selisih Universitas Sumatera Utara 25 kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.

3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1 L dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Kurs porselin bersama isinya dipijarkan perlahan hingga arang habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 26

3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, dinginkan, dan ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.

3.7 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dari serbuk simplisia, ekstrak etanol, n-hesana dan etilasetat meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin, tanin, glikosida, glikosida antrakinon dan steroidatriterpenoida Depkes, 1995; Farnsworth, 1966. Prosedur pemeriksaan ekstrak etanol dan fraksi herba sawi tanah sama seperti prosedur skrining fitokimia terhadap simplisia herba sawi tanah. 3.7.1 Pemeriksaan alkaloida Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanasakan di atas penangas air selama 2 menit. Didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut : a. Filtrat sebayak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Universitas Sumatera Utara 27 Serbuk mengandung alkaloida jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan dengan menggunakan dua golongan larutan percobaan yang digunakan Depkes RI, 1995.

3.7.2 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 20 ml air panas, dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml a mil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.7.3 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.

3.7.4 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Jika terjadi warna hijau, biru, atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.

3.7.5 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3, ditambahkan asam sulfat pekat hingga diperoleh pH 2, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Sebanyak 20 ml Universitas Sumatera Utara 28 filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan dengan temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut: a. Larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula. b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air. Larutkan sisa dalam 5 ml asam asetat anhidrat. Tambahkan 10 tetes asam sulfat pekat, akan terjadi warna biru atau hijau, menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1995.

3.7.6 Pemeriksaan glikosida antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon Depkes RI, 1995.

3.7.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Farnsworth, 1966. Universitas Sumatera Utara 29

3.8 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Cara kerja : Sebanyak 250 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 75 bagian pelarut 1875 ml etanol 80, dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibiarkan pada suhu kamar selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, kemudian setelah 5 hari hasil maserasi disaring dan diperas. Ampas ditambah dengan cairan penyari etanol 80 hingga diperoleh 100 bagian 2,5 L maserat kemudian dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari dan dienaptuangkan. Seluruh maserat digabungkan lalu diuapkan dengan alat rotary evaporator pada temperatur kurang lebih 40 o C dan diperoleh ekstrak etanol kental kemudian dikeringkan dengan freeze dryer. Ditjen POM, 1979. Bagan pembuatan ekstrak etanol secara maserasi dapat dilihat di Lampiran 5, halaman 52.

3.9 Pembuatan Fraksi n-Heksana dan Fraksi Etilasetat