Pembuatan Fraksi n-Heksana dan Fraksi Etilasetat Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi Pembiakan Bakteri .1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri

29

3.8 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Cara kerja : Sebanyak 250 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 75 bagian pelarut 1875 ml etanol 80, dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibiarkan pada suhu kamar selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, kemudian setelah 5 hari hasil maserasi disaring dan diperas. Ampas ditambah dengan cairan penyari etanol 80 hingga diperoleh 100 bagian 2,5 L maserat kemudian dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari dan dienaptuangkan. Seluruh maserat digabungkan lalu diuapkan dengan alat rotary evaporator pada temperatur kurang lebih 40 o C dan diperoleh ekstrak etanol kental kemudian dikeringkan dengan freeze dryer. Ditjen POM, 1979. Bagan pembuatan ekstrak etanol secara maserasi dapat dilihat di Lampiran 5, halaman 52.

3.9 Pembuatan Fraksi n-Heksana dan Fraksi Etilasetat

Prosedur fraksinasi dilakukan menurut Harbone 1987: Pembuatan fraksi-fraksi dilakukan secara ekstraksi cair-cair ECC menggunakan pelarut n-heksana dan etilasetat. Sebanyak 10 g ekstrak etanol ditambahkan 40 ml etanol dan 100 ml air suling dihomogenkan lalu dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian diekstraksi dengan 50 ml n-heksana, dikocok, didiamkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu fraksi n-heksana dan fraksi air. Fraksi n- heksana dikumpulkan dan fraksinasi dilakukan sampai lapisan n-heksana jernih. Fraksi air kemudian diekstraksi dengan 50 ml etilasetat, dikocok, didiamkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu fraksi etilasetat dan fraksi air. Fraksi etilasetat dikumpulkan Universitas Sumatera Utara 30 dan fraksinasi dilakukan sampai lapisan etilasetat jernih. Fraksi n-heksana dan etilasetat diuapkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Bagan pembuatan fraksi dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 53.

3.10 Pembuatan Larutan Uji Dengan Berbagai Konsentrasi

Ekstrak etanol herba sawi tanah ditimbang 1 g kemudian dilarutkan dengan pelarut DMSO hingga 2 ml maka konsentrasi ekstrak adalah 500 mgml. Larutan tersebut diencerkan kembali dengan pelarut DMSO sehingga didapat konsentrasi 400 mgml; 300 mgml; 200 mgml; 100 mgml; 75 mg ml; 50 mgml; 25 mg ml; 12,5 mgml. Dilakukan prosedur yang sama dengan fraksi n-heksana dan fraksi etilasetat. 3.11 Pembiakan Bakteri 3.11.1 Pembuatan Stok Kultur Bakteri Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril. Koloni bakteri tersebut kemudian ditanamkan pada media nutrient agar miring dengan cara menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36  1 o C selama 18 - 24 jam. 3.11.2 Penyiapan inokulum bakteri Koloni bakteri diambil dari stok kultur bakteri yang telah tumbuh pada media nutrient agar miring diambil dengan menggunakan jarum ose steril. Koloni bakteri tersebut kemudian disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 10 ml larutan nutrient broth, kemudian diukur kekeruhan larutan menggunakan alat spektrofotometer visible pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara 31

3.12 Uji Aktivitas Antibakteri