Menurut farmakope Indonesia Ed. IV, lempeng yang dilapisi dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada
adsorbsi, partisi, atau kombinasi dari keduanya, tergantung dari jenis zat penyangga, cara pembuatan dan jenis pelarut yang digunakan.
Campuran yang akan di kromatografi harus dilarutkan dalam pelarut yang agak nonpolar untuk ditotolkan pada lapisan. Hampir segala macam pelarut dapat dipakai, tapi
yang terbaik yang bertitik didih 50-100 C. pelarut yang demikian mudah ditangani dan
mudah menguap dari lapisan. Larutan uji ditotolkan pada plat KLT diikuti dengan penotolan larutan baku. Setelah dilakukan pengelusian, lapisan tersebut kemudian
disemprot dengan suatu pereaksi, yang akan menimbulkan bercak warna setelah bereaksi dengan cuplikan. Maka noda larutan uji akan menunjukkan warna dan harga Rf yang
sama dengan noda larutan baku. Gritter, 1991
2.4.2.2 Uji kuantitatif
Pengujian hidrokortison dapat dilakukan dengan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT atau High
Perpormance Liquid Chromatography HPLC merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan
dan cairan biologi karena sederhana dan kepekaannya tinggi. KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar, jadi senyawa yang tidak tahan panas dapat ditangani dengan mudah.
Peralatan KCKT memiliki kepekaan yang sangat tinggi sehingga menghasilkan data yang lebih akurat dan membutuhkan waktu yang tidak lama.
Universitas Sumatera Utara
Kemajuan dalam tekhnologi kolom , sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan pada KCKT menjadi suatu sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. KCKT digunakan untuk senyawa-senyawa tidak atsiri, berbobot molekul tinggi,
anorganik, tidak tahan panas dan lain sebagainya. Kepekaan dari peralatan KCKT sangat tinggi sehingga menghasilkan data yang lebih akurat dan membutuhkan waktu yang tidak
lama. Cepatnya perkembangan KCKT didukung oleh perkembangan peralatan yang handal dan kolom yang efisien. Munson, 1991
KCKT pada saat ini merupakan metode kromatografi cair paling akhir. Dalam beberapa tahun terakhir ini tekhnologi KCKT dan pemakaiannya sangat berkembang,
walaupun membutuhkan biaya yang relatif tidak sedikit tapi saat ini merupakan suatu tekhnik yang banyak digunakan pada perusahaan obat. Diantaranya adalah PT. Kimia
Farma persero Tbk. Plant Medan. KCKT merupakan salah satu metode yang mempunyai banyak keuntungan,
diantaranya adalah sebagai berikut: 1.
Cepat ; untuk analisis yang tidak rumit, dapat dicapai waktu analisis kurang dari 5 menit.
2. Daya pisahnya baik ; kemampuan pelarut berinteraksi dengan fase diam dan fase
gerak memberikan parameter pencapaian pemisahan yang dikehendaki. 3.
Peka detector unik ; detector yang dipakai adalah uv 254 nm yang dapat mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram.
Universitas Sumatera Utara
4. Kolom dapat dipakai kembali tetapi mutunya turun. Laju penurunan mutunya
bergantung pada jenis cuplikan yang disuntikkan, kemurnian pelarut,dan jenis pelarut yang dipakai.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion. Mudah memperoleh kembali cuplikan ; karena
detector tidak merusak cuplikan. Pelarut dapat dihilangkan dengan penguapan . Johnson, 1991
Pada dasarnya alat KCKT terdiri dari : 1.
Sistem Pompa Pompa harus tahan terhadap semua jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai
6000 psi , harus bebas denyut, dan dapat menghantarkan aliran terukur 0,01 – 1,0 atau 0,1 - 20 ml menit. Selain itu, pompa harus mempunyai batas volume minimum sehingga
memungkinkan pergantian pelarut dengan cepat dan elusi landaian secara efisien. Laju aliran biasanya dikendalikan dengan tombol pada pompa normal atau dengan
mikroprosesor pada pompa niaga yang lebih canggih. Gritter,1991 2.
Tandon pelarut Bahan tandon harus lembab terhadap fase gerak berair dan tidak berair. Sehingga
baja anti karat dan gelas menjadi pilihan. Baja anti karat jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika tandon harus bertekanan, hindari penggunaan gelas.
Daya tampung tandon harus lebih dari 500 ml digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir 1 – 2 ml menit. Munson, 1991
Universitas Sumatera Utara
3. Pipa
Pipa merupakan penyambung dari seluruh bagian sistem. Garis tengah dalam pipa sebelum penyuntik tidak berpengaruh, hanya saja harus lembab, tahan tekanan dan
mampu dilewati pelarut dengan volume yang memadai. Munson, 1991 4.
Penyuntik Sistem penyuntik Cuplikan Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian
maksimum pada analisis kuantitatif, yang terpenting adalah sistem harus dapat mengatasi tekanan balik yang tinggi tanpa kehilangan terokan fase gerak . Pada saat pengisian
terokan, terokan dialirkan melewati keluk dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk
kolom. Munson, 1991 5.
Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf, kebersihan atau kegagalan analisis
tergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Dianjurkan untuk mamasang penyaring 2 μm dijalur antar penyuntik dan kolom, untuk menahan partikel yang dibawa
fase gerak atau terokan, hal ini dapat memperpanjang umur kolom. Munson, 1991 Kolom dapat dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu :
a. Kolom analitik :
garis tengah dalam 2-6mm. untuk kemasan makropartikel panjang kolom 50 - 100 cm, untuk kemasan mikropartikel biasanya panjang kolomnya 10-30 cm.
b. Kolom preparatif :
garis tengah 6 mm atau lebih panjang 25-100 cm. Johnson,1991.
Universitas Sumatera Utara
Pemilihan kolom yang dipakai untuk cuplikan yang sifatnya tidak dikenal berdasarkan pada sifat kimia umum linarut, sifat kelarutan dan ukurannya. Kolom dapat
dikemas sendiri atau membeli kolom yang sudah dikemas. KCKT biasanya adalah UV 254 nm. Bila tanggapan detektor lebih lambat dari elusi sampel timbullah pelebaran pita
yang memperburuk pemisahan. Pemilihan detektor KCKT tergantung pada sifat sampel, fase gerak dan kepekaan yang tinggi dicapai. Gritter, 1991
6. Detektor
Detektor harus memberikan cuplikan , tanggapan yang dapat diramalkan , peka, hasil yang efisien dan tidak terpengarung oleh perubahan suhu atau komposisi fase
gerak. Detektor yang dipakai pada KCKT biasanya adalah UV 254 nm. Bila tanggapan detektor lebih lambat dari elusi sampel timbullah pelebaran pita yang memperburuk
pemisahan. pemilihan detektor KCKT tergantung pada sifat sampel, fase gerak dan kepekaan yang tinggi dicapai. Mu
6. Penguat Sinyal
nson, 1991
Pada umumnya sinyal yang berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu sebelum disampaikan pada alat perekam otomatik yang sesuai, biasanya berupa suatu
perekam potensiometrik. Dapat pula sinyal dikirimkan kepada suatu integrator digital elektronik untuk mengukur luas puncak kromatogram secara otomatik. Munson, 1991
7. Perekam Perekam merupakan salah satu dari bagian peralatan yang berfungsi merekam
atau menunjukkan hasil pemeriksaan suatu senyawa berupa peak puncak.Dari daftar
Universitas Sumatera Utara
tersebut, secara kualitatif kita dapat mengetahui senyawa apa yang diperiksa Munson,1991.
Dalam pemisahan suatu senyawa secara KCKT biasanya digunakan suatu pelarut landaian yaitu pelarut yang dapat diubah-ubah kepolarannya sesuai dengan
kebutuhan. Ada beberapa keuntungan jika digunakan pelarut landaian, diantaranya :
a. Waktu analisis keseluruhan dapat berkurang
b. Daya pisah keseluruhan persatuan waktu campuran ditingkatkan
c. Bentuk puncak diperbaiki pembentukan ekor lebih kecil
d. Kepekaan efek ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam.
Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu perubahan yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dapat digunakan
dalam metode KCKT tetapi harus memenuhi beberapa kriteria berikut ini : 1.
Murni tanpa cemaran 2.
Tidak bereaksi dengan kemasan 3.
Sesuai dengan detektor 4.
Dapat melarutkan cuplikan 5.
Mempunyai viskositas rendah 6.
Mudah memperoleh kembali cuplikan 7.
Harganya wajar. johnson,1991.
Universitas Sumatera Utara
Prinsip dari metode KCKT adalah : Bila sampel telah dimasukkan dengan suatu penyuntik KCKT, maka akan dibawa melalui
kolom bersama suatu fase gerak akibat adanya tekanan dari pompa. Data yang dihasilkan ditunjukkan berupa puncak oleh suatu perekam.
2.4.3 Pembuatan Krim Hidrokortison 2.4.3.1 Proses pembuatan krim dalam industri
