BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
2. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
3. Spektrofotometer UV-Vis
4. Tabung PerkolasiMaserasi 5000 mL
Schoot Duran 5.
Rotarievaporator Bűchi R-114
6. Labu rotarievaporator
1000 mL Schoot Duran
7. Alat destilasi Ekstraktor
8. Corong pisah
500 ml Pyrex
9. Kolom Kromatografi
10. Botol vial 10 mL
11. Neraca analitis Mettler AE 200
12. Lampu UV 254 nm356 nm UVGL 58
13. Penangas air 14. Chamber
15. Gelas Ukur Pyrex
16. Gelas Beaker Pyrex
17. Gelas Erlenmeyer Pyrex
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Daun Pirdot
2. Metanol
Destilasi 3.
Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana
Teknis 6.
Kloroform Teknis
7. FeCl
3
5 8.
Pereaksi Benedict 9.
HCl 6 10. Kapas
11. 12.
Silika gel 40 70-230meshASTM Plat KLT Silika gel 60 F
254
E.Merck. KgA E.Merck.Art 554
13. Plat KLT Preparatif 60 F
254
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun pirdot yang diperoleh dari Desa Dolog Huluan, Kecamatan Raya, Kabupaten Simalungun. Daun pirdot dikeringkan di udara terbuka,
lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun pirdot sebanyak 2400 g.
3.3.2 UjiPendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Pirdot
Serbuk daun pirdot diidentifikasi dengan menggunakan cara skrining fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun pirdot maka
dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna. Serbuk daun pirdot yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam dua gelas erlenmeyer. Kemudian
erlenmeyer I dilarutkan dengan 100 mL metanol dan erlenmeyer II dilarutkan dengan 100 mL etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
Kemudian didiamkan selama 1 malam dan dilakukan penyaringan.Ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat yang didapat dimasukkan kedalam masing-masing
tabung reaksi, lalu ditambahkan pereaksi FeCl
3
5. a. Tabung I ekstrak metanol : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam.
b. Tabung II ekstrak etil asetat : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam.
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Pirdot
Serbuk daun pirdot ditimbang sebanyak 2400 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 30 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam.
Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu
diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana
sampai lapisan n-heksana negatif dengan FeCl
3
5. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan
kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu dihidrolisis dengan menggunakan HCl
6 sambil di panaskan diatas penangas air selama ± 1 jam setelah mendidih. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh diektraksi partisi dengan kloroform
sampai larutan negatif dengan FeCl
3
5. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform
sebanyak 1,38 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipisterhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck.Ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Universitas Sumatera Utara
Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.Dimasukkan 100 mL campuran
larutan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT.
Dimasukkan plat ke dalam bejana yang berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi, dikeluarkan, lalu
dikeringkan.Diamati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi denganFeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil asetat dengan
perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40
70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.Dirangkai
alat kromatografi kolom.Dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan etil asetat, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam
kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 1,38 g ekstrak pekat kloroform dengan
silika gel dengan n-heksana, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat
90:10 vv secara perlahan-lahan sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan
menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ±
10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentukpasta.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Pemurnian
Pastayang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan metanol lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang
diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai unuk KLT preparatif. Kloroform 100 adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan
paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkanpastayang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama
rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisipelarut yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi,
plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan hasilnya diperiksa di bawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusidenganmetanol:etil asetat 1:1. Hasil
elusi diuapkan hingga diperolehpastakuning kecoklatan.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian pastadilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 70:30vv dan kloroform:aseton 70:30 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkanpasta yang sebelumnya dilarutkan dengan metanol
pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat
KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi Panjang Gelombang dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia–LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan pelarut Metanol Gambar 4.1.
3.3.8.2 Identifikasi Gugus Fungsi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimi–LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan KBr Gambar 4.2.
3.3.8.3Identifikasi Proton dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia–LIPI,Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan pelarut Metanol Gambar 4.3.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
- Ekstraksi Maserasi dengan pelarut Metanol
Daun tumbuhan Pirdot S.vulcani Korth.
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan
Ekstrak metanol ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Larutan hitam positif fenolik
dirajang
- Ekstraksi Maserasi dengan pelarut Etil asetat
Daun tumbuhan Pirdot S.vulcani Korth.
diekstraksi maserasi dengan etil asetat disaring
dipekatkan
Ekstrak etil asetat ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Larutan hitam positif fenolik
dirajang
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
2400 g serbuk daun tumbuhan Pirdot S.vulcani Korth.
dimaserasi dengan metanol sebanyak 30 L didiamkan selama ± 24 jam
diulangi sampai sampel negatif dengan FeCl
3
5 disaring
Ekstrak metanol diskrining fitokimia
dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat secara berulang-ulang sampai larutan negatif dengan FeCl
3
5 disaring
Ekstrak etil asetat Residu
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana secara berulang-ulang sampai larutan negatif dengan FeCl
3
5 Lapisan metanol
Lapisan n-heksana senyawa organik non polar
negatif dengan FeCl
3
5 tidak dilanjutkan
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict + dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 1 jam
didinginkan disaring
Ekstrak metanol asam Residu
senyawa gula diekstraksi partisi dengan kloroform sampai larutan negatif dengan FeCl
3
5 Lapisan kloroform
Lapisan Metanol Asam
dipekatkan Ekstrak pekat kloroform
Ampas
diuapkan hingga semua etil asetat menguap
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Ekstrak pekat kloroform diskrining fitokimia
diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen yang sesuai dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak n-heksana:etil asetat
90:10; 80:20; 70:30; 60:40
v v
ditampung tiap fraksi sebanyak 10 mL dalam botol vial diuji KLT untuk mengetahui harga Rf yang sama
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 43-55 70:30 diuji FeCl
3
5 Hasil positif
dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dipreparatif dengan eluen kloroform 100
dikeringkan disinari di bawah lampu UV
digerus dari plat dilarutkan dengan campuran metanol:etil asetat 1:1
disaring
Senyawa hasil isolasi dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
diuapkan dianalisis dengan
spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer Inframerah FT-IR,
spektrometer
1
H-NMR Hasil Analisis
Fraksi 12-19 90:10 diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Fraksi 20-42 80:20 diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Fraksi 56-98 60:40 diuji FeCl
3
5 Hasil positif
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
Kategori