BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini merupakan penelitian Post Test Only Control Group Design
dengan jenis penelitian eksperimental laboratorium dan dilaksanakan secara in vitro
.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara USU untuk pembuatan ekstrak Jahe merah dan di
Laboratorium Biologi Oral Universitas Airlangga UNAIR untuk pengujian efektivitas antibakteri.
Waktu penelitian adalah pada bulan Desember 2015-Februari 2016.
3.3 Sampel dan Besar Sampel 3.3.1 Sampel Penelitian
Sampel penelitian adalah koloni Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah diisolasi dan dibiakkan dalam media Nutrient Agar.
3.3.2 Besar Sampel Penelitian
Adapun penentuan besar sampel dilakukan berdasarkan standar Laboratorium Biologi Oral Universitas Airlangga. Jumlah pengulangan yang dilakukan pada
penelitian ini menggunakan rumus Federer, yaitu:
Universitas Sumatera Utara
5-1 r-1 ≥ 15
4r-4 ≥ 15
4r ≥ 19
r ≥ 4,75
r ≥ 5
Jumlah perlakuan ulang r yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5 kali pengulangan.
a. Penentuan nilai KHM
Bahan coba dibagi kedalam 5 kelompok dengan 2 kontrol, yaitu: -
Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100 = 5 sampel
- Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50
= 5 sampel -
Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25 = 5 sampel
- Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel
- Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25 = 5 sampel
- Kelompok VI : kontrol Mc. Farland
= 1 sampel -
Kelompok VII : kontrol negatif ekstrak Jahe merah tanpa suspensi Porphyromonas gingivalis
= 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel
Dari masing-masing konsentrasi dilakukan dilusi pengenceran untuk mendapatkan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
t-1 r-1 ≥
15 Keterangan :
t : jumlah perlakuan dalam penelitian r : jumlah perlakuan ulang sampel
Universitas Sumatera Utara
b. Penentuan nilai KBM Dari hasil penentuan nilai KHM diperoleh beberapa kelompok yang
dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode swab. -
Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100 = 5 sampel
- Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50
= 5 sampel -
Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25 = 5 sampel
- Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5 = 5 sampel
- Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25 = 5 sampel
- Kelompok VI : kontrol Mc. Farland
= 1 sampel -
Kelompok VII : kontrol negatif ekstrak Jahe merah tanpa suspensi Porphyromonas gingivalis
= 1 sampel Jumlah sampel = 27 sampel
3.4 Variabel dan Definisi Operasional 3.4.1 Variabel Penelitian
Variabel Bebas
- Ekstrak Jahe merah dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan
6,25.
Variabel Tergantung
- Pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis pada media Nutrient Agar
dengan pengukuran nilai KHM dan KBM
Variabel Terkendali
- Asal Jahe merah Kutacane
- Konsentrasi etanol yang dipakai 96
- Suspensi P. gingivalis ATCC 33277
- Jenis media pembiakan bakteri Nutrient Agar
Universitas Sumatera Utara
- Suhu inkubasi P. gingivalis 37
o
C -
Waktu yang digunakan untuk mengamati pertumbuhan atau pembiakan P. gingivalis
yaitu 24 jam
Variabel Tak Terkendali
- Lama penyimpanan Jahe merah
- Lama penyimpanan, pengiriman, dan suhu saat pengiriman bahan coba
ekstrak Jahe merah ke laboratorium.
3.4.2 Definisi Operasional
No. Variabel
Definisi Operasional Cara Ukur
Skala Ukur Alat Ukur
1. Ekstrak Jahe
merah dengan
konsentrasi 100
Ekstrak yang diperoleh dengan melarutkan 20 gram
ekstrak Jahe merah ke dalam 20 ml DMSO
Sesuai SOP Laboratorium
Biologi Oral UNAIR
Rasio Electronic
Balance, Gelas
Ukur 2.
Ekstrak Jahe merah
dengan konsentrasi 50
Ekstrak yang diperoleh dengan melarutkan ½ ekstrak
Jahe merah konsentrasi 100 ke dalam 20 ml
DMSO Mikropipet
3. Ekstrak Jahe
merah dengan
konsentrasi 25 Ekstrak yang diperoleh
dengan melarutkan ½ ekstrak Jahe merah konsentrasi 50
ke dalam 20 ml DMSO 4.
Ekstrak Jahe merah
dengan konsentrasi
12,5 Ekstrak yang diperoleh
dengan melarutkan ½ ekstrak Jahe merah konsentrasi 25
ke dalam 20 ml DMSO
Universitas Sumatera Utara
5. Ekstrak Jahe
merah dengan
konsentrasi 6,25
Ekstrak yang diperoleh dengan melarutkan ½ ekstrak
Jahe merah konsentrasi 12,5 ke dalam 20 ml
DMSO 6.
Konsentrasi Hambat
Minimum KHM
Konsentrasi minimal bahan coba yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi
selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada
media perbenihan. Menggunakan
metode dilusi
Rasio Cahaya Ruangan
7. Konsentrasi
Bunuh Minimum
KBM Konsentrasi minimal bahan
coba yang dapat membunuh 99,9 atau 100 bakteri
setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam, dengan
menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat.
Menggunakan metode Swab
Visual
3.5 Alat dan Bahan Penelitian 3.5.1 Alat Penelitian
- Lemari pengering
- Kertas perkamen
- Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
- Perkolator
- Kapas Bio Panca, Indonesia
- Aluminium foil 1 gulungan
- Erlenmeyer Pyrex, USA
- Destilator
Universitas Sumatera Utara
- Lemari penyimpan petri
- Piring petri Pyrex, Japan
- Blender Panasonic, Japan
- Kertas saring Whatman no. 42, England
- Autoklaf Tomy, Japan
- Inkubator CO
2
Sanyo, Japan -
Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan -
DMSO -
Pipet mikro dan tips Gilson, France -
Ose -
Spiritus
3.5.2 Bahan Penelitian
- Jahe merah sebanyak 1500 gram
- Pelarut etanol 96 sebanyak 1 liter Kimia Farma, Indonesia
- Suspensi Porphyromonas gingivalis ATCC 33277
- Media Nutrient Agar Difco, USA
- NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia
- Aquades 1 liter
3.6 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.6.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Jahe Merah
Jahe merah yang digunakan adalah Jahe merah yang segar. Bahan baku berupa Jahe merah sebanyak 1500 gram yang dicuci bersih, dibuang kulitnya, dan
diiris halus. Jahe merah yang telah diiris halus ditimbang, didapat beratnya adalah 890 gram. Selanjutnya Jahe merah dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari
sampai benar-benar kering.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2. Jahe merah dicuci dan dibersihkan Gambar 3. Jahe merah yang telah dari kotoran
dikupas
Gambar 4. Jahe merah diiris tipis-tipis Gambar 5. Jahe merah dikeringkan
Gambar 6. Jahe merah kering yang sudah dihaluskan
Universitas Sumatera Utara
Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia. Diayak dan ditimbang kembali dan didapatkan berat 150 gram. Simplisia
kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96 dan sesekali diaduk. Setelah itu dimasukkan ke dalam perkolator yang
ditutup aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan
dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan
tetesan ±20 tetesmenit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan
perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada
tekanan 1 ATM dengan temperatur ≤55
C. Hasil akhir yang didapat adalah ekstrak Jahe merah sebanyak 100 gram.
3.6.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak Jahe merah ditimbang menggunakan Electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan
dengan DMSO. Disediakan 5 buah tabung, pada tabung pertama diisi 20 gram ekstrak Jahe merah dan dilarutkan dengan DMSO. Kemudian dicampur dengan
menggunakan DMSO sehingga diperoleh 20 ml ekstrak Jahe merah dengan konsentrasi 100. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil ½ dari
ekstrak Jahe merah konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung kedua untuk mendapatkan 20 ml ekstrak Jahe merah 50 pengenceran
ganda. Demikian seterusnya sampai didapatkan konsentrasi 25, 12,5, dan 6,25. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media dengan melarutkan 20 gram bubuk Nutrient Agar ke dalam 500 ml aquades untuk 40 petri 20 mlpetri.
Kemudian media disterilkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121
C. Simpan media yang telah disterilkan di dalam lemari pendingin.
3.6.4 Pembiakan Suspensi Bakteri
Bakteri Porphyromonas gingivalis yang tersedia dalam kemasan stik dibiakkan pada media Nutrient Agar dengan metode swab. Waktu inkubasi yang
dibutuhkan hingga bakteri berada dalam fase stasioner adalah 5x24 jam dalam keadaan anaerob pada suhu 37
C. Pembuatan suspensi bakteri menggunakan Porphyromonas gingivalis ATCC
33277 yang telah dibiakkan secara murni pada media Nutrient Agar dalam suasana anaerob. Biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur,
sebanyak 1-2 ose disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc. Farland atau sebanding dengan jumlah
bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.6.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Sebanyak 2 ml suspensi bakteri diambil dengan
menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam piring petri.
Universitas Sumatera Utara
3.6.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak Jahe merah tanpa suspensi bakteri. Sebanyak 2 ml ekstrak Jahe merah diambil menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam piring petri.
3.6.7 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak Jahe merah yang digunakan terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25. Sebanyak 1 ml dari masing-masing konsentrasi
diambil lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai dengan konsentrasinya. Selanjutnya 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan
sebelumnya diambil menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing- masing tabung reaksi bahan coba yang telah diberi label kemudian dihomogenkan.
Tabung-tabung tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam pada
inkubator CO
2
dan kekeruhan yang terjadi diamati dengan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing
bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal bahan uji yang
mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam
perbenihan tersebut.
3.6.8 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM, tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih, sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan perhitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25 dengan metode swab. Bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing dihomogenkan
dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi kemudian diteteskan ke dalam media padat
Universitas Sumatera Utara
Nutrient Agar, diswab dan direplikasi 5 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai
mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam.
Perhitungan jumlah koloni bakteri dilakukan secara visual dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan menjadi satu koloni bakteri.
Perhitungannya adalah apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni.
Satuan yang digunakan adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
3.7 Alur Penelitian
Pembuatan ekstrak Jahe merah
Pengenceran bahan coba
Analisis data Penentuan KBM bahan coba
Penentuan KHM bahan coba Pembuatan kontrol negatif
Pembuatan kontrol positif Pembuatan suspensi bakteri
Pembuatan media bakteri
Universitas Sumatera Utara
3.8 Analisis Data
Data hasil penelitian diperoleh dengan menghitung jumlah bakteri yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak Jahe merah dengan konsentrasi 100, 50, 25,
12,5 dan 6,25 pada media Nutrient Agar secara visual.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL PENELITIAN
Setelah didapatkan ekstrak Jahe merah, dilakukan uji efektivitas antibakteri untuk menentukan nilai Konsentrasi Hambat Minimum KHM dan Konsentrasi
Bunuh Minimum KBM. Uji efektivitas ekstrak Jahe merah dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 ini dilakukan pada bakteri Porphyromonas
gingivalis yang telah dikultur pada media Nutrient Agar.
Penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum KHM pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode dilusi cair. Penentuan nilai KHM bertujuan
untuk mengetahui konsentrasi minimal ekstrak Jahe merah yang mampu menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media perbenihan setelah diinkubasi
selama 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam perbenihan tersebut. Namun pada hasil tidak terlihat jelas larutan yang mulai tampak jernih meskipun ekstrak Jahe
merah mungkin efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis
.
Gambar 7. Kejernihan pada tabung percobaan yang tidak terlihat jelas
Universitas Sumatera Utara