18
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian deskriptif dengan metode spektrofotometri derivatif terhadap analisa hidrokortison asetat dan kloramfenikol
yang terkandung pada sediaan krim merek X.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan September 2015 di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.3 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer UV-Visible dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 35, Personal Computer PC
yang dilengkapi software UV Probe 2.42 UV-1800 Shimadzu, neraca analitik Mettler Toledo, kuvet, kertas saring, bola karet, spatula, alat-alat gelas dan alat-
alat lainnya yang diperlukan dalam penyiapan sampel.
3.4 Bahan
Bahan yang digunakan adalah etanol absolut Moffat, dkk., 2005, baku kloramfenikol, hidrokortison asetat BPFI sertifikat pengujian dapat dilihat pada
Lampiran 25 dan 26 halaman 103 dan 104 dan krim yang mengandung hidrokortison asetat dan kloramfenikol.
Universitas Sumatera Utara
19
3.5 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama
dengan yang diteliti Sudjana, 2005. Sampel yang digunakan yaitu krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg. Gambar
sediaan dan daftar spesifikasi sediaan krim dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 48 dan 49.
3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku dan Larutan Standar
3.6.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Hidrokortison Asetat
Ditimbang dengan seksama 50 mg baku pembanding kloramfenikol kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml
dengan etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500
gml LIB I. Dari larutan LIB I dipipet 0,5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 25
ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 50
gml LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol
Dibuat larutan induk kloramfenikol dengan melarutkan 50 mg serbuk baku kloramfenikol dalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan 10 ml dengan
etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500
gmL LIB I.
Universitas Sumatera Utara
20 Dari larutan LIB I dipipet 0,5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 mL,
dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 5
0 gmL LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.
3.6.1.3 Pembuatan Larutan Standar Hidrokortison Asetat
Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 ml yang memiliki konsentrasi masing-masing 6
gml, 8 gml, 10 gml, 12 gml, dan 14 gml, dengan cara mengencerkan sebanyak 1,2 ml, 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; dan 2,8 ml
secara berurutan dari LIB II hidrokortison asetat menggunakan pelarut etanol absolut. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.
3.6.1.4 Pembuatan Larutan Standar Kloramfenikol
Diambil sebanyak 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; 2,8 ml; dan 3,2 ml dari LIB II kloramfenikol. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 5 labu tentukur
10 ml. Dilarutkan dengan pelarut etanol absolut. Kemudian dicukupkan dengan pelarut yang sama untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi 8
gml; 10 µgml, 12
gml; 14 µgml; dan 16 gml. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53.
3.6.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum 3.6.2.1 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Hidrokortison Asetat
Diambil sebanyak 2 ml dari LIB II hidrokortison asetat konsentrasi = 10
gml kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 ml untuk kemudian dilarutkan dengan etanol absolut. Selanjutnya larutan diencerkan dengan pelarut
yang sama hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh
Universitas Sumatera Utara
21 larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10
gml. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada
Lampiran 4 halaman 51.
3.6.2.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kloramfenikol
Diambil sebanyak 2,4 mL dari LIB II kloramfenikol konsentrasi = 12 gmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan
dengan pelarut etanol absolut hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 12
gmL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada
Lampiran 4 halaman 53.
3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif 3.6.3.1 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Hidrokortison Asetat
Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6
gml, 8 gml, 10 gml, 12 gml, dan 14
gml pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan
Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.
3.6.3.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Kloramfenikol
Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8
gml; 10 gml; 12 gml; 14 gml; dan 16 gml pada panjang gelombang 200–400 nm. Kemudian spektrum
ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan
Universitas Sumatera Utara
22 Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman
54.
3.6.4 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dalam berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing
masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.
3.6.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Dibuat larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 gml, larutan
kloramfenikol dengan konsentrasi 8 gml, dan larutan campuran hidrokortison
asetat 10 gml dan kloramfenikol 8 gml. Kemudian ketiga larutan ini diukur
serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm. Selanjutnya ditransformasikan
menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dari masing-masing zat tunggal dan dari campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol. Spektrum
serapan derivat kedua dari larutan zat tunggal dan campuran keduanya ditumpangtindihkan. Yang dipilih untuk menjadi panjang gelombang analisis
adalah yang pada panjang gelombang tertentu, serapan tunggal salah satu senyawa nol sedangkan serapan tunggal senyawa pasangannya dan campuran keduanya
hampir sama atau persis sama. Karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan salah satu senyawa tanpa diganggu oleh serapan
senyawa pasangannya.
Universitas Sumatera Utara
23
3.6.6 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi 3.6.6.1 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Hidrokortison
Asetat
Dibuat larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6 gmL; 8
gmL; 10 gmL; 12 gmL; dan 14 gmL, kemudian diukur serapan derivat kedua Δ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan.
Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai
serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan limit deteksi limit of detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation
LOQ.Untuk menentukan batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ dapat digunakan rumus :
Keterangan : SB = Simpangan baku
LOD = Limit of Detection LOQ = Limit of Quantitation
3.6.6.2 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol
Dibuat larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8 gml; 10
gml; 12 gml; 14 gml dan 16 gml, kemudian diukur serapan derivat kedua Δ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian
Universitas Sumatera Utara
24 dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga
diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan perhitungan limit deteksi limit of
detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation LOQ. Perhitungan untuk menentukan LOD dan LOQ seperti rumus sebelumnya.
3.6.7 Penentuan Kadar Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol dalam Sediaan Krim
Ditimbang tube krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg kemudian dikeluarkan isinya dari dalam tube,
kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass. Selanjutnya ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 25 mg hidrokortison asetat, dihitung kesetaraan
hidrokortison asetat yang terkandung di dalamnya penimbangan krim dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu tentukur 50
ml, dan ditambahkan etanol absolute 10 ml, disonikasi selama 15 menit, sampai larut, kemudian dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda, dikocok
sampai homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 ml filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari filtrat ini dipipet
sebanyak 0,5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang didalamnya
terdapat hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 gml dan kloramfenikol
konsentrasi 8 gml. Diukur serapan pada panjang gelombang 200−400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan
derivat kedua dengan Δ 2 nm pada panjang gelombang analisis hidrokortison
Universitas Sumatera Utara
25 asetat dan kloramfenikol masing-masing 222,2 nm dan 228,4 nm. Bagan alir
prosedur penelitian penentuan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 55.
3.6.8 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji T. Tabel distribusi t dapat dilihat pada
Lampiran 16 halaman 87-90. Rumus yang digunakan adalah :
SD =
1 -
n X
- Xi
2
Untuk mencari t hitung digunakan rumus:
t
hitung
= n
SD X
Xi
Data diterima jika t
hitung
t
tabel
pada interval kepercayaan 99 dengan nilai α = 0,01.
Keterangan : SD
= standard deviation simpangan baku Xi
= kadar dalam satu perlakuan
X
= Kadar rata-rata dalam satu sampel mg100g n
= jumlah pengulangan α
= tingkat kepercayaan
Universitas Sumatera Utara
26 Menurut Sudjana 2005 untuk menghitung kadar hidrokortison asetat dan
kloramfenikol sebenarnya dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus: µ =
X
± [t α2, dk x SD √n ]
Keterangan : SD = standard deviation simpangan baku
X
= Kadar rata-rata dalam satu sampel n
= jumlah perlakuan t
= harga t
tabel
sesuai dengan derajat kepercayaan
3.6.9 Uji Validasi 3.6.9.1 Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan bahan baku yaitu dengan membuat 3 konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80, 100,
120. Dimana pada masing-masing rentang spesifik digunakan 70 sampel dan 30 baku yang akan ditambahkan Harmita, 2004.
Kemudian campuran sampel dan baku diukur serapannya pada panjang gelombang 200
– 400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum
serapan derivat kedua dengan Δ 2 nm pada panjang gelombang analisis hidrokortison asetat dan kloramfenikol masing-masing
222,2 nm dan 228,4 nm. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:
perolehan kembali = 100
Keterangan: C
F
= Konsentrasi sampel setelah penambahan bahan baku C
A
= Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku C
A
= Jumlah baku yang ditambahkan
Universitas Sumatera Utara
27
3.6.9.2 Uji Presisi
Presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan
adanya keseksamaan metode yang dilakukan Harmita, 2004. Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus berikut ini :
RSD = Keterangan
: = Kadar rata-rata sampel
SD = Standard Deviation RSD = Relative Standar Deviation
Universitas Sumatera Utara
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penentuan Spektrum Serapan Maksimum
Penentuan spektrum serapan maksimum dilakukan pada panjang gelombang 200
–400 nm. Pengukuran hidrokortison asetat pada konsentrasi 10 gmL, sedangkan untuk kloramfenikol pada konsentrasi 12 gml. Berdasarkan
hasil penelitian, diperoleh panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat pada 241,8 nm dan kloramfenikol pada 273,4 nm. Spektrum serapan maksimum
hidrokortison asetat konsentrasi 10 gml dan kloramfenikol konsentrasi 12 gml
masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan 4.2.
nm. 200,00
250,00 300,00
350,00 400,00
A bs.
0,526 0,400
0,200
0,000 -0,052
Gambar 4.1 Spektrum serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10
gml
Universitas Sumatera Utara
29
nm. 200,00
250,00 300,00
350,00 400,00
A bs.
0,706 0,600
0,400
0,200
0,000 -0,062
Gambar 4.2 Spektrum serapan maksimum kloramfenikol konsentrasi 12
gml
nm . 200,00
250,00 300,00
350,00 400,00
Ab s.
0,600
0,400
0,200
0,000
Gambar 4.3 Spektrum tumpang tindih serapan maksimum hidrokortison asetat
konsentrasi 10µgml dan kloramfenikol konsentrasi 12 µgml Dari Gambar 4.3 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan
hidrokortison asetat dan kloramfenikol terdapat serapan yang berimpit. Berdasarkan hasil spektrum tumpang tindih serapan maksimum diatas maka tidak
dapat dilakukan penetapan kadar masing-masing komponen maka dilakukan derivatisasi.
Hidrokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 12 µgml
Universitas Sumatera Utara
30
4.2 Hasil Penentuan Spektrum Serapan
Ketika dilakukan orientasi dengan berbagai konsentrasi yaitu 6 µgml, 8 µgml, 10 µgml, 12 µgml, 14 µgml dan untuk kloramfenikol dengan konsentrasi
8 µgml, 10 µgml, 12µgml, 14 µgml, 16 µgml, ternyata konsentrasi yang terbaik adalah 8 µgml:10 µgml dengan perbandingan 4:5. Hasil penentuan
spectrum serapan dibuat terhadap larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 µgml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8µgml, kemudian dibuat
spektrum serapan pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan dari hidrokortison asetat 10 µgml dan kloramfenikol 8 µgmL masing-masing dapat
dilihat pada Gambar 4.4 dan Gambar 4.5. Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat 10 µgmL dan kloramfenikol 8 µgmL dapat dilihat pada
Gambar 4.6.
nm . 200,00
250,00 300,00
350,00 400,00
Ab s.
0,600
0,400
0,200
0,000
Gambar 4.4 Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgml
Universitas Sumatera Utara
31
nm . 212.71
250.00 300.00
350.00 400.00
Ab s.
0.5258 0.4000
0.2000
0.0000 -0.0521
Gambar 4.5 Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 8 µgmL
nm . 200,00
250,00 300,00
350,00 400,00
Ab s.
0,600
0,400
0,200
0,000
Gambar 4.6 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan
kloramfenikol Dari Gambar 4.6 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan
hidrokortison asetat 10 µgmL dan kloramfenikol 8 µgmL terdapat serapan yang berimpit. Maka dilakukan derivatisasi untuk memperoleh zero crossing terhadap
masing-masing komponen.
4.3 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat 4.3.1 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Pertama
Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgmL dan kloramfenikol konsentrasi 8 µgmL ditransformasikan menjadi spektrum serapan
Hidrokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 8 µgml
Universitas Sumatera Utara
32 derivat pertama dengan
Δ = 2 nm. Hasil penentuan zero crossing pada derivat pertama diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan derivat
pertama pada masing-masing zat. Zero crossing pada spektrum derivat pertama dari masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki
serapan nol. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada spektrum serapan derivat pertama masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan 4.8.
Spektrum tumpang
tindih serapan
hidrokortison asetat
dan kloramfenikol dapat dilihat pada Gambar 4.9.
nm . 212.71
250.00 300.00
350.00 400.00
Ab s.
0.0200 0.0100
0.0000 -0.0100
-0.0200 -0.0221
Gambar 4.7 Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgmL pada
derivat pertama
nm . 212.71
250.00 300.00
350.00 400.00
Ab s.
0.0200 0.0100
0.0000 -0.0100
-0.0200 -0.0221
Gambar 4.8 Spektrum serapan kloramfenikol 8 µgmL pada derivat pertama
Universitas Sumatera Utara
33
nm . 212.71
250.00 300.00
350.00 400.00
Ab s.
0.0200 0.0100
0.0000 -0.0100
-0.0200 -0.0221
Gambar 4.9 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan
kloramfenikol pada derivat pertama
Dari Gambar 4.9 dapat dilihat hasil tumpang tindih serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgml dan kloramfenikol konsentrasi
8 µgml tidak diperoleh zero crossing sehingga tidak dapat dilakukan penentuan kadar masing-masing zat maka dilanjutkan pada derivat kedua.
4.3.2 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Kedua
Hasil penentuan spektrum serapan derivat kedua dibuat dengan terlebih dahulu membuat spectrum serapan dari larutan hidrokortison
asetatdengan konsentrasi 10 µgml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µgml pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan yang telah
diperoleh ditransformasikan menjadi spektrum se rapan derivat kedua dengan ∆
2 nm. Spektrum serapan derivat kedua dari masing-masing zat tersebut ditumpangtindihkan. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada
serapan derivat kedua dapat dilihat pada Gambar 4.10 dan 4.11. Spektrum tumpang tindih hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada serapan derivat
kedua pada Gambar 4.12.
Hidokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 8 µgml
Universitas Sumatera Utara
34
nm . 212.71
250.00 300.00
320.00
Ab s.
0.0060 0.0050
0.0000
-0.0050 -0.0060
Gambar 4.10 Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi
10 µgml
nm . 212.71
250.00 300.00
320.00
Ab s.
0.0060 0.0050
0.0000
-0.0050 -0.0060
Gambar 4.11 Spektrum serapan derivat kedua kloramfenikol konsentrasi 8
µgml
Universitas Sumatera Utara
35
nm . 212.71
250.00 300.00
320.00
Ab s.
0.0060 0.0050
0.0000
-0.0050 -0.0060
301.4 nm 293.8 nm
287.4 nm 257.4 nm
255.6 nm 228.4 nm
222.2 nm
Gambar 4.12 Spektrum tumpang tindih serapan derivat kedua hidrokortison
asetat dan kloramfenikol Dari Gambar 4.12 dapat dilihat tumpang tindih serapan hidrokortison
asetat dan kloramfenikol diperoleh hasil zero crossing pada serapan derivat kedua terdapat pada panjang gelombang 222,20 nm, 256,80 nm dan 257,60 untuk
hidrokotison asetat. Sedangkan pada panjang gelombang 228,40 nm, 255,60 nm dan 293,8 nm untuk kloramfenikol. Hasil zero crossing dari hidrokortison asetat
dan kloramfenikol digunakan untuk penentuan kadar campuran kedua komponen tersebut.
4.4 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Analisis Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol