Jenis Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Alat Bahan Pengambilan Sampel Hasil Penentuan Spektrum Serapan

18

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian deskriptif dengan metode spektrofotometri derivatif terhadap analisa hidrokortison asetat dan kloramfenikol yang terkandung pada sediaan krim merek X.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan September 2015 di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

3.3 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer UV-Visible dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 35, Personal Computer PC yang dilengkapi software UV Probe 2.42 UV-1800 Shimadzu, neraca analitik Mettler Toledo, kuvet, kertas saring, bola karet, spatula, alat-alat gelas dan alat- alat lainnya yang diperlukan dalam penyiapan sampel.

3.4 Bahan

Bahan yang digunakan adalah etanol absolut Moffat, dkk., 2005, baku kloramfenikol, hidrokortison asetat BPFI sertifikat pengujian dapat dilihat pada Lampiran 25 dan 26 halaman 103 dan 104 dan krim yang mengandung hidrokortison asetat dan kloramfenikol. Universitas Sumatera Utara 19

3.5 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, yaitu ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang terambil mempunyai karakteristik yang sama dengan yang diteliti Sudjana, 2005. Sampel yang digunakan yaitu krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg. Gambar sediaan dan daftar spesifikasi sediaan krim dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2 halaman 48 dan 49. 3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku dan Larutan Standar 3.6.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku Hidrokortison Asetat Ditimbang dengan seksama 50 mg baku pembanding kloramfenikol kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml dengan etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500 gml LIB I. Dari larutan LIB I dipipet 0,5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 50 gml LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.

3.6.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol

Dibuat larutan induk kloramfenikol dengan melarutkan 50 mg serbuk baku kloramfenikol dalam labu tentukur 100 mL, ditambahkan 10 ml dengan etanol absolut hingga larut, dicukupkan volume dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 500 gmL LIB I. Universitas Sumatera Utara 20 Dari larutan LIB I dipipet 0,5 mL dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 mL, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 5 0 gmL LIB II. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.

3.6.1.3 Pembuatan Larutan Standar Hidrokortison Asetat

Larutan standar dibuat dalam 5 labu tentukur 10 ml yang memiliki konsentrasi masing-masing 6 gml, 8 gml, 10 gml, 12 gml, dan 14 gml, dengan cara mengencerkan sebanyak 1,2 ml, 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; dan 2,8 ml secara berurutan dari LIB II hidrokortison asetat menggunakan pelarut etanol absolut. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.

3.6.1.4 Pembuatan Larutan Standar Kloramfenikol

Diambil sebanyak 1,6 ml; 2 ml; 2,4 ml; 2,8 ml; dan 3,2 ml dari LIB II kloramfenikol. Kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam 5 labu tentukur 10 ml. Dilarutkan dengan pelarut etanol absolut. Kemudian dicukupkan dengan pelarut yang sama untuk membuat larutan standar dengan konsentrasi 8 gml; 10 µgml, 12 gml; 14 µgml; dan 16 gml. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53. 3.6.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum 3.6.2.1 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Hidrokortison Asetat Diambil sebanyak 2 ml dari LIB II hidrokortison asetat konsentrasi = 10 gml kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 ml untuk kemudian dilarutkan dengan etanol absolut. Selanjutnya larutan diencerkan dengan pelarut yang sama hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh Universitas Sumatera Utara 21 larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 gml. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 51.

3.6.2.2 Pembuatan Spektrum Serapan Maksimum Kloramfenikol

Diambil sebanyak 2,4 mL dari LIB II kloramfenikol konsentrasi = 12 gmL kemudian dimasukan ke dalam labu tentukur 10 mL untuk diencerkan dengan pelarut etanol absolut hingga garis tanda, lalu dikocok sampai homogen untuk memperoleh larutan dengan konsentrasi 12 gmL. Diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 53. 3.6.3 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif 3.6.3.1 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Hidrokortison Asetat Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6 gml, 8 gml, 10 gml, 12 gml, dan 14 gml pada panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 52.

3.6.3.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Kloramfenikol

Dibuat spektrum serapan tanpa diderivatkan dari larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8 gml; 10 gml; 12 gml; 14 gml; dan 16 gml pada panjang gelombang 200–400 nm. Kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dengan Universitas Sumatera Utara 22 Δ = 2 nm. Bagan alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 54.

3.6.4 Penentuan Zero Crossing

Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan masing-masing derivat dalam berbagai konsentrasi larutan. Zero crossing masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.

3.6.5 Penentuan Panjang Gelombang Analisis

Dibuat larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 gml, larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8 gml, dan larutan campuran hidrokortison asetat 10 gml dan kloramfenikol 8 gml. Kemudian ketiga larutan ini diukur serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm. Selanjutnya ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan kedua dari masing-masing zat tunggal dan dari campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol. Spektrum serapan derivat kedua dari larutan zat tunggal dan campuran keduanya ditumpangtindihkan. Yang dipilih untuk menjadi panjang gelombang analisis adalah yang pada panjang gelombang tertentu, serapan tunggal salah satu senyawa nol sedangkan serapan tunggal senyawa pasangannya dan campuran keduanya hampir sama atau persis sama. Karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan salah satu senyawa tanpa diganggu oleh serapan senyawa pasangannya. Universitas Sumatera Utara 23 3.6.6 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi 3.6.6.1 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Hidrokortison Asetat Dibuat larutan standar hidrokortison asetat dengan konsentrasi 6 gmL; 8 gmL; 10 gmL; 12 gmL; dan 14 gmL, kemudian diukur serapan derivat kedua Δ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan pula perhitungan limit deteksi limit of detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation LOQ.Untuk menentukan batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ dapat digunakan rumus : Keterangan : SB = Simpangan baku LOD = Limit of Detection LOQ = Limit of Quantitation

3.6.6.2 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol

Dibuat larutan standar kloramfenikol dengan konsentrasi 8 gml; 10 gml; 12 gml; 14 gml dan 16 gml, kemudian diukur serapan derivat kedua Δ = 2 nm pada panjang gelombang analisis yang telah ditentukan. Kemudian Universitas Sumatera Utara 24 dilakukan analisis hubungan antara konsentrasi dan nilai serapan sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = ax + b. Dan berdasarkan nilai serapan pada panjang gelombang analisis, dilakukan perhitungan limit deteksi limit of detection LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation LOQ. Perhitungan untuk menentukan LOD dan LOQ seperti rumus sebelumnya.

3.6.7 Penentuan Kadar Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol dalam Sediaan Krim

Ditimbang tube krim merek X yang mengandung hidrokortison asetat 25 mg dan kloramfenikol 20 mg kemudian dikeluarkan isinya dari dalam tube, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass. Selanjutnya ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan 25 mg hidrokortison asetat, dihitung kesetaraan hidrokortison asetat yang terkandung di dalamnya penimbangan krim dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dan ditambahkan etanol absolute 10 ml, disonikasi selama 15 menit, sampai larut, kemudian dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda, dikocok sampai homogen. Larutan tersebut kemudian disaring, lebih kurang 10 ml filtrat pertama dibuang. Filtrat selanjutnya ditampung. Kemudian dari filtrat ini dipipet sebanyak 0,5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan etanol absolut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan yang didalamnya terdapat hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 gml dan kloramfenikol konsentrasi 8 gml. Diukur serapan pada panjang gelombang 200−400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δ 2 nm pada panjang gelombang analisis hidrokortison Universitas Sumatera Utara 25 asetat dan kloramfenikol masing-masing 222,2 nm dan 228,4 nm. Bagan alir prosedur penelitian penentuan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada lampiran 4 halaman 55.

3.6.8 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik

Data perhitungan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji T. Tabel distribusi t dapat dilihat pada Lampiran 16 halaman 87-90. Rumus yang digunakan adalah : SD =   1 - n X - Xi 2  Untuk mencari t hitung digunakan rumus: t hitung = n SD X Xi  Data diterima jika t hitung t tabel pada interval kepercayaan 99 dengan nilai α = 0,01. Keterangan : SD = standard deviation simpangan baku Xi = kadar dalam satu perlakuan  X = Kadar rata-rata dalam satu sampel mg100g n = jumlah pengulangan α = tingkat kepercayaan Universitas Sumatera Utara 26 Menurut Sudjana 2005 untuk menghitung kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol sebenarnya dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus: µ = X ± [t α2, dk x SD √n ] Keterangan : SD = standard deviation simpangan baku  X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = jumlah perlakuan t = harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan 3.6.9 Uji Validasi 3.6.9.1 Uji Akurasi Uji akurasi dilakukan dengan metode penambahan bahan baku yaitu dengan membuat 3 konsentrasi analit sampel dengan rentang spesifik 80, 100, 120. Dimana pada masing-masing rentang spesifik digunakan 70 sampel dan 30 baku yang akan ditambahkan Harmita, 2004. Kemudian campuran sampel dan baku diukur serapannya pada panjang gelombang 200 – 400 nm, selanjutnya spektrum serapan ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat kedua dengan Δ 2 nm pada panjang gelombang analisis hidrokortison asetat dan kloramfenikol masing-masing 222,2 nm dan 228,4 nm. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus: perolehan kembali = 100 Keterangan: C F = Konsentrasi sampel setelah penambahan bahan baku C A = Konsentrasi sampel sebelum penambahan bahan baku C A = Jumlah baku yang ditambahkan Universitas Sumatera Utara 27

3.6.9.2 Uji Presisi

Presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan Harmita, 2004. Simpangan baku relatif dapat dihitung dengan rumus berikut ini : RSD = Keterangan : = Kadar rata-rata sampel SD = Standard Deviation RSD = Relative Standar Deviation Universitas Sumatera Utara 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penentuan Spektrum Serapan Maksimum Penentuan spektrum serapan maksimum dilakukan pada panjang gelombang 200 –400 nm. Pengukuran hidrokortison asetat pada konsentrasi 10 gmL, sedangkan untuk kloramfenikol pada konsentrasi 12 gml. Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat pada 241,8 nm dan kloramfenikol pada 273,4 nm. Spektrum serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10 gml dan kloramfenikol konsentrasi 12 gml masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan 4.2. nm. 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 A bs. 0,526 0,400 0,200 0,000 -0,052 Gambar 4.1 Spektrum serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10 gml Universitas Sumatera Utara 29 nm. 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 A bs. 0,706 0,600 0,400 0,200 0,000 -0,062 Gambar 4.2 Spektrum serapan maksimum kloramfenikol konsentrasi 12 gml nm . 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 Ab s. 0,600 0,400 0,200 0,000 Gambar 4.3 Spektrum tumpang tindih serapan maksimum hidrokortison asetat konsentrasi 10µgml dan kloramfenikol konsentrasi 12 µgml Dari Gambar 4.3 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol terdapat serapan yang berimpit. Berdasarkan hasil spektrum tumpang tindih serapan maksimum diatas maka tidak dapat dilakukan penetapan kadar masing-masing komponen maka dilakukan derivatisasi. Hidrokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 12 µgml Universitas Sumatera Utara 30

4.2 Hasil Penentuan Spektrum Serapan

Ketika dilakukan orientasi dengan berbagai konsentrasi yaitu 6 µgml, 8 µgml, 10 µgml, 12 µgml, 14 µgml dan untuk kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µgml, 10 µgml, 12µgml, 14 µgml, 16 µgml, ternyata konsentrasi yang terbaik adalah 8 µgml:10 µgml dengan perbandingan 4:5. Hasil penentuan spectrum serapan dibuat terhadap larutan hidrokortison asetat dengan konsentrasi 10 µgml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8µgml, kemudian dibuat spektrum serapan pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan dari hidrokortison asetat 10 µgml dan kloramfenikol 8 µgmL masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Gambar 4.5. Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat 10 µgmL dan kloramfenikol 8 µgmL dapat dilihat pada Gambar 4.6. nm . 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 Ab s. 0,600 0,400 0,200 0,000 Gambar 4.4 Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgml Universitas Sumatera Utara 31 nm . 212.71 250.00 300.00 350.00 400.00 Ab s. 0.5258 0.4000 0.2000 0.0000 -0.0521 Gambar 4.5 Spektrum serapan kloramfenikol konsentrasi 8 µgmL nm . 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 Ab s. 0,600 0,400 0,200 0,000 Gambar 4.6 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol Dari Gambar 4.6 dapat dilihat bahwa hasil tumpang tindih serapan hidrokortison asetat 10 µgmL dan kloramfenikol 8 µgmL terdapat serapan yang berimpit. Maka dilakukan derivatisasi untuk memperoleh zero crossing terhadap masing-masing komponen. 4.3 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat 4.3.1 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Pertama Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgmL dan kloramfenikol konsentrasi 8 µgmL ditransformasikan menjadi spektrum serapan Hidrokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 8 µgml Universitas Sumatera Utara 32 derivat pertama dengan Δ = 2 nm. Hasil penentuan zero crossing pada derivat pertama diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan derivat pertama pada masing-masing zat. Zero crossing pada spektrum derivat pertama dari masing-masing zat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada spektrum serapan derivat pertama masing-masing dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan 4.8. Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat dilihat pada Gambar 4.9. nm . 212.71 250.00 300.00 350.00 400.00 Ab s. 0.0200 0.0100 0.0000 -0.0100 -0.0200 -0.0221 Gambar 4.7 Spektrum serapan hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgmL pada derivat pertama nm . 212.71 250.00 300.00 350.00 400.00 Ab s. 0.0200 0.0100 0.0000 -0.0100 -0.0200 -0.0221 Gambar 4.8 Spektrum serapan kloramfenikol 8 µgmL pada derivat pertama Universitas Sumatera Utara 33 nm . 212.71 250.00 300.00 350.00 400.00 Ab s. 0.0200 0.0100 0.0000 -0.0100 -0.0200 -0.0221 Gambar 4.9 Spektrum tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada derivat pertama Dari Gambar 4.9 dapat dilihat hasil tumpang tindih serapan derivat pertama hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgml dan kloramfenikol konsentrasi 8 µgml tidak diperoleh zero crossing sehingga tidak dapat dilakukan penentuan kadar masing-masing zat maka dilanjutkan pada derivat kedua.

4.3.2 Penentuan Zero crossing pada Serapan Derivat Kedua

Hasil penentuan spektrum serapan derivat kedua dibuat dengan terlebih dahulu membuat spectrum serapan dari larutan hidrokortison asetatdengan konsentrasi 10 µgml dan larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 8 µgml pada panjang gelombang 200-400 nm. Spektrum serapan yang telah diperoleh ditransformasikan menjadi spektrum se rapan derivat kedua dengan ∆ 2 nm. Spektrum serapan derivat kedua dari masing-masing zat tersebut ditumpangtindihkan. Spektrum hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada serapan derivat kedua dapat dilihat pada Gambar 4.10 dan 4.11. Spektrum tumpang tindih hidrokortison asetat dan kloramfenikol pada serapan derivat kedua pada Gambar 4.12. Hidokortison asetat 10 µgml Kloramfenikol 8 µgml Universitas Sumatera Utara 34 nm . 212.71 250.00 300.00 320.00 Ab s. 0.0060 0.0050 0.0000 -0.0050 -0.0060 Gambar 4.10 Spektrum serapan derivat kedua hidrokortison asetat konsentrasi 10 µgml nm . 212.71 250.00 300.00 320.00 Ab s. 0.0060 0.0050 0.0000 -0.0050 -0.0060 Gambar 4.11 Spektrum serapan derivat kedua kloramfenikol konsentrasi 8 µgml Universitas Sumatera Utara 35 nm . 212.71 250.00 300.00 320.00 Ab s. 0.0060 0.0050 0.0000 -0.0050 -0.0060 301.4 nm 293.8 nm 287.4 nm 257.4 nm 255.6 nm 228.4 nm 222.2 nm Gambar 4.12 Spektrum tumpang tindih serapan derivat kedua hidrokortison asetat dan kloramfenikol Dari Gambar 4.12 dapat dilihat tumpang tindih serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol diperoleh hasil zero crossing pada serapan derivat kedua terdapat pada panjang gelombang 222,20 nm, 256,80 nm dan 257,60 untuk hidrokotison asetat. Sedangkan pada panjang gelombang 228,40 nm, 255,60 nm dan 293,8 nm untuk kloramfenikol. Hasil zero crossing dari hidrokortison asetat dan kloramfenikol digunakan untuk penentuan kadar campuran kedua komponen tersebut.

4.4 Hasil Penentuan Panjang Gelombang Analisis Hidrokortison asetat dan Kloramfenikol