UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
nonbonding dan tidak mengabsobpsi radiasi pada diatas 200 bn akan tetapi
menabsobrsi sinar UV jauh Harmita, 2006.
2.3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan teknik pemisahan untuk analisis dan pemurniaan senyawa tertentu dalam suatu sampel pada
sejumlah bidang tertentu, antara lain : farmasi, bioteknologi, polimer, dan industri makanan. Pemisahan pada senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis, analisis ketidakmurniaan, senyawa-senyawa yang tidak menguap. KCKT sering digunakan untuk penetapan kadar senyawa-senyawa seperti
asam-asam amino, protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa- senyawa aktif obat Gandjar Rohman, 2007.
2.3.1. Metode Dalam Kromatografi Cair
Dibagi atas dua macam: a.
Kromatografi Cair Retensif Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam.
Tipe ini mencakup fase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion. b.
Kromatografi Cair Non-retensi Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat
terlarut dimana terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori-pori yang terdapat di permukaan fase diam.
Harmita, 2006.
2.3.2. Keuntungan
a. Waktu analisa cepat
Waktu yang diperlukan biasanya kurang dari satu jam, sering kali hanya 15 menit hingga 30 menit, untuk analisa yang mudah yang diperlukan
kurang dari 5 menit. b.
Daya pisahnya baik. c.
Peka.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kepekaannya sangat tergantung pada jenis detektor dan eluen yang digunakan.
d. Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi.
e. Kolom dapat dipakai kembali.
f. Mudah untuk molekul besar dan kecil.
g. Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan, tidak sperti kebanyakaan
detektor dalam kromatografi gas, detektor KCKT tidak merusak komponen zat yang di analisis, sehingga zat yang telah dielusi dapat dikumpulkan
dengan mudah setelah melewati detektor. h.
Dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah, hal ini sangat bergantung kepada detektor yang digunakan, namun detektor KCKT dapat
mendeteksi zat sampai dengan kadar ppt. Harmita, 2006.
2.3.3. Komponen KCKT
a. Pompa
Pompa berfungsi untuk mengalirkan eluen ke dalam kolom, pompa dan segel-segel pompa dan semua penghubung dalam sistem kromatografi harus
terbuat dari bahan yang secra kimia terhadap fase gerak. b.
Injektor Injektor untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom
Jenis-jenis injektor : 1.
Aliran henti Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer, setelah
sistem ditutup aliran dilanjutkan kembali. 2.
Septum Merupakan injektor langsung pada aliran, dapat dipakai pada tekanan
sampai 60-70 atm tetapi tidak dapat dipakai untuk pelarut kromatografi cair.
3. Katup jalan kitar
Biasa dipakai untuk menyuntikkan volume yang lebih dari 10 µl. 4.
Auto injektor
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Merupakan otomatisasi dari katup jalan kitar. c.
Kolom Berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen, kolom yang ada
telah tersedia dalam berbagai macam ukuran. Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat bahan yang kokoh seperti stainless atau campuran
logam dengan gelas, isi kolom dijaga oleh penahan yang ada di ujung-ujung kolom.
Kolom standar mempunyai diameter dalam antara 4-5 mm. Isi kolom harus homogen dan stabil secara mekanik. Diameter partikel berkisar antara 4-7
panjang kolom sekitar 10-30 cm, kecepatan analisis merupakan pertimbangan utama, Kolom dengan diameter dalam yang kecil 2 mm
dibandingkan dengan kolom standar pada kondisi isokratik akan menghasilkan waktu analisis yang sama.
d. Detektor
Detektor berfungsi untuk mendeteksi atau mengidentifikasi komponen yang ada dalam eluat dan mengukur jumlahnya.
Macam-macam Detektor : 1.
Detektor Spektrofotometri UV-Vis Detektor ini berdasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet
UV dan sinar tampak Vis pada kisaran panjang gelombang 190- 800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur-struktur atau
gugus-gugus kromoforik. 2.
Detektor indeks bias Merupakan detektor yang bersifat universal sel yang mampu
memberikan respon, pada setiap zat terlarut. Detektor ini akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara analit zat terlarut
dengan pelarutnya fase geraknya. 3.
Detektor fluoresensi Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika
suatu senyawa menyerap sinar UV atau visibel lalu mengemisikan pada panjang gelombang yang lebih besar, tidak semua senyawa obat
mempunyai sifat fluoresen sehingga fluoresen detektor ini sangat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sensitif, disamping itu, detektor ini sangat sensitif dibandingkan dengan detektor UV.
4. Detektor elektrokimia
Banyak senyawa organik termasuk obat dapat dioksidasi atau direduksi secara elektrokimia pada elektroda yang cocok, kepekaan
detektor elektrokimia umumnya tinggi, detektor elektrokimia yang paling sering digunakan adalah detektor konduktivitas dan detektor
amperometri. Gandjar Rohman, 2007
e. Fase Gerak
Senyawa yang akan dipisahkan harus larut dalam pelarut yang digunakan, pelarut ini tidak perlu tepat sama dengan eluen yang di gunakan, akan tetapi
pelarut tersebut harus dapat larut di dalam eluen. Untuk kromatografi partisi fase normal, pelarut harus dipilih agar menghasilkan viskositas
terendah yang sesuai dengan persyaratan pompa, dan paling sering dipilih adalah kloroform karena tekanan uapnya rendah, sedangkan untuk
kromatografi terbalik asetonitril merupakan pelarut pilihan untuk dicampur dengan air, campuran ini viskositasnya lebih rendah dari pada
campuran metanol-air dan biasanya menghasilkan efesiensi kolom yang baik.
Secara umum sifat eluen yang baik:
1. Murni
2. Tidak bereaksi dengan kolom
3. Sesuai dengan detektor
4. Dapat melarutkan cuplikan
5. Selektif terhadap komponen
6. Viskositas rendah
7. Mudah memperoleh cuplikan kembali bila diperlukan
8. Harga wajar
9. Dapat memisahkan zat dengan baik
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pemilihan fase gerak berdasarkan pada :
1. Kesesuaian dengan mekanisme pemisahan
2. Kemampuannya untuk melarutkan cuplikan
3. Kepolaran yang dapat di ubah dengan mengubah komposisi
2.3.4. Analisa Kromatografi
