Alat-alat Bahan-bahan Pembuatan Ekstrak Buah Belimbing Manis .1 Pembuatan Ekstrak Metanol

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental. Tahap penelitian meliputi penyiapan bahan, karakteristik simplisia, skrining fitokimia simplisia, dan pembuatan ekstrak. Selanjutnya pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi agar menggunakan silinder logam. Parameter yang dilihat adalah besarnya diameter hambat pertumbuhan bakteri dan jamur. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.

3.1 Alat-alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Philips, bola karet, desikator, freeze dryer Modulio, inkubator Fiber Scientific, jangka sorong, jarum ose, kamera digital Sony, kompor Sharp, krus porselin, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin Toshiba, lumpang dan alu, mikroskop, neraca kasar Sun, neraca listrik Vibra AJ, oven Memmert, penangas air Yenaco, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator Haake D, seperangkat alat penetapan kadar air, silinder logam, spektrofotometer visibel Dynamic dan tanur.

3.2 Bahan-bahan

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah buah belimbing manis, nutrient agar, potato dextrose agar, Staphylococcus aureus ATCC No. 6538, Escherichia coli ATCC No. 25922, Candida albicans ATCC No. 10231, Universitas Sumatera Utara Microsporum gypseum Biofarma, air suling, larutan NaCl 0,9, bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali dinyatakan lain: alfa naftol, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam asetat glasial, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, etanol, eter minyak tanah, etilasetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat, dan toluena. 3.3 Penyiapan Bahan 3.3.1 Pengambilan Bahan Pengambilan bahan dilakukan secara purposif sengaja yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Umur bahan yang diambil tidak diperhitungkan. Sampel yang digunakan adalah buah belimbing manis Averrhoa carambola Linn. yang diperoleh dari Pancurbatu, Kabupaten Deli Serdang, Sumatera Utara.

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor.

3.3.3 Pembuatan Simplisia

Buah belimbing manis yang telah dikumpulkan sebanyak 10 kg dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan kemudian dipotong secara melintang. Buah ini kemudian dikeringkan di lemari pengering pada suhu 40-60 C hingga kering, dimana jika simplisia tersebut sudah kering maka dapat diremas dan hancur, Universitas Sumatera Utara kemudian ditimbang sebagai berat kering. Selanjutnya simplisia diserbuk menggunakan blender, disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat, terlindung dari panas dan sinar matahari. 3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Asam Klorida 2 N Sebanyak 17 ml asam klorida pekat dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 ml Depkes RI, 1979.

3.4.2 Pereaksi Asam Sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat kemudian diencerkan dengan air suling hingga 100 ml. Depkes RI, 1979.

3.4.3 Pereaksi Besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.4 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.5 Pereaksi Dragendorff

Campur 20 ml larutan bismuth nitrat P 40 dalam asam nitrat P dengan 50 ml larutan kalium yodida P 54,4, diamkan sampai memisah sempurna. Ambil larutan jernih dan encerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.4.6 Pereaksi Kloralhidrat

Sebanyak 70 g kloralhidrat dilarutkan dalam 100 ml air Depkes RI, 1979.

3.4.7 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat kemudian ditambahkan etanol hingga 50 ml Harborne,1987.

3.4.8 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,35 g raksa II klorida dilarutkan dalam 60 ml air suling. Kemudian pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air lalu campurkan keduanya dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.9 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g alfa-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga volume 100 ml Ditjen POM, 1995.

3.4.10 Pereaksi Natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1979.

3.4.11 Pereaksi Timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air bebas karbondioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1989. Universitas Sumatera Utara

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam. 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, bau, dan rasa simplisia buah belimbing manis Averrhoa carambola Linn. fructus.

3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat kemudian ditutup dengan kaca penutup, setelah itu dilihat di bawah mikroskop. Sebagai pembanding, untuk melihat susunan anatomis maka diperiksa juga penampang melintang bahan segar dan penampang melintang biji.

3.5.3 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Cara kerja : Ke dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Toluen didinginkan selama 30 menit dan volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Universitas Sumatera Utara Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.

3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air

Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform P 2,5 ml kloroform P dalam air suling sampai 1 liter menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan sisa pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI,

1995. 3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1979.

3.5.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1979.

3.6 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia serbuk simplisia buah belimbung manis meliputi: pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, saponin, flavonoid, antrakinon, tanin dan triterpenoidsteroid. 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk tes alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada tabung : Universitas Sumatera Utara a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit 2 tabung reaksi dari percobaan diatas Depkes RI, 1989.

3.6.2 Pemeriksaan Glikosida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volum air suling ditambah dengan 10 ml asam klorida 2N. Direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4M, lalu dikocok selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut, yaitu 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat. Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu Depkes RI, 1979.

3.6.3 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1- 10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1979. Universitas Sumatera Utara

3.6.4 Pemeriksaan Flavonoid

Sebanyak 10 g sebuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.6.5 Pemeriksaan Antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambahkan 5 ml asam sulfat 2N, dipanaskan sebentar, dinginkan. Tambahkan 10 ml benzena, kocok, diamkan. Pisahkan lapisan benzen, saring; filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzena dengan 1-2 ml natrium hidroksida 2N, diamkan; lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI, 1995.

3.6.6 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1979.

3.6.7 Pemeriksaan Triterpenoidsteroid

Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna biru atau hijau Universitas Sumatera Utara menunjukkan adanya steroida dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoida Farnsworth, 1966. 3.7 Pembuatan Ekstrak Buah Belimbing Manis 3.7.1 Pembuatan Ekstrak Metanol Sebanyak 600 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah gelas berwarna gelap lalu dimaserasi dengan 750 ml pelarut metanol selama 5 hari terlindung dari cahaya matahari sambil sering diaduk, lalu diserkai, diperas dengan kain flanel. Lalu ampas ditambahkan cairan penyari secukupnya sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 1000 ml, kemudian didiamkan selama 2 hari dan dienap tuangkan. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40 C dan di freeze dryer sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Dan ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 89,6 g.