18
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni yang bersifat eksploratif, dengan metode desain faktorial untuk mencari formula sediaan gel
antiinflamasi ekstrak daun petai cina yang memenuhi persyaratan sifat fisik gel.
B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah level natrium
alginat dan Na-CMC yang digunakan dalam formula. b.
Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik dan stabilitas dari sediaan gel, yang meliputi daya sebar, viskositas,
dan pergeseran viskositas selama penyimpanan 4 minggu, kecepatan pengurangan inflamasi.
c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini adalah lama pencampuran, kecepatan mixing saat pembuatan, sumber daun petai cina, lama penyimpanan gel, kondisi
penyimpanan gel, galur hewan uji, usia hewan uji, berat badan hewan uji, dan jenis kelamin hewan uji.
d. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali
dalam penelitian ini adalah suhu dan kelembaban selama pembuatan dan
penyimpanan sediaan gel, interkasi antar komponen, dan keadaan fisiologis hewan uji.
2. Definisi operasional
a. Optimasi adalah proses untuk mendapatkan formula optimum dalam
level yang diteliti. b.
Gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina adalah sediaan semipadat yang dibuat dari ekstrak daun petai cina dengan menggunakan gelling agent
natrium alginat dan Na-CMC dengan formula yang telah ditentukan pada penelitian ini.
c. Antiinflamasi adalah sediaan yang dapat mengurangi gejala-gejala
peradangan d.
Simplisia daun petai cina adalah daun petai cina yang telah dikeringkan dan kemudian dihaluskan hingga menjadi serbuk.
e. Ekstrak daun petai cina adalah hasil maserasi simplisia daun petai cina
dengan menggunakan 500 mL pelarut etanol 96 : air 1:1 selama 3 hari dalam suhu ruangan, dan remaserasi dengan menggunakan 500 mL
pelarut etanol 96. f.
Gelling agent adalah bahan pembawa dalam sediaan gel yang dapat mempengaruhi sifat fisik sediaan gel, dalam penelitian ini digunakan
Natrium alginat dan Na-CMC. g.
Sifat fisik dan stabilitas gel adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui kualitas fisik dari sediaan gel. Dalam penelitian ini sifat fisik
meliputi daya sebar, dan viskositas, sedangkan stabilitas gel adalah pergeseran viskositas gel selama penyimpanan 4 minggu.
h. Faktorial desain adalah metode optimasi yang digunakan untuk
mengetahui efek yang dominan dalam sifat fisik dan stabilitas gel melalui analisis hasil secara statistik.
i. Faktor adalah variabel yang diteliti di dalam penelitian natrium alginat
dan Na-CMC. j.
Respon adalah besaran yang diamati, perubahan efek dan besarnya dapat dinyatakan secara kuantitatif. Dalam penelitian ini adalah sifat fisik dan
stabilitas gel. k.
Level adalah tetapan atau nilai dari suatu faktor yang dinyatakan secara numerik.
l. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan oleh variasi level dan
faktor. m.
Viskositas adalah ketahanan gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina untuk mengalir setelah adanya pemberian gaya.
n. Daya sebar adalah diameter penyebaran tiap 1 gram gel antiinflamasi
ekstrak daun petai cina pada alat uji daya sebar yang diberi beban 125 gram dan didiamkan selama 1 menit.
o. Pergeseran viskositas adalah selisih dari viskositas gel antiinflamasi
ekstrak daun petai cina setelah 4 minggu penyimpanan dalam suhu kamar dengan viskositas gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina setelah 2 hari
pembuatan yang dipersentasekan.
p. Contour plot adalah grafik yang merupakan area optimum dari formula
yang menunjukkan parameter sediaan gel yang baik. q.
Area optimum adalah area dari komposisi natrium alginat dan Na-CMC yang memberikan sifat fisik dan stabilitas gel yang baik, yaitu daya sebar
4-5 cm, viskositas 250-350 dPas, serta perubahan viskositas selama penyimpanan ≤ 10.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun petai cina, etanol 96 p.a., Natrium alginat farmasetis, Na-CMC farmasetis,
propilenglikol farmasetis, methyl paraben farmasetis, nutrient agar, aquadest, 6 ekor tikus jantan galur SD yang berumur 2-3 bulan dengan berat 200-300 g.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware Pyrex- Germany, mixer Maspion, viscometer seri VT 04 RION-JAPAN, stopwatch,
waterbath, neraca analitik, seperangkat alat maserasi, Laminar Air Flow LAF, oven, autoklaf, vakum rotary evaporator, pompa vakum, kertas indikator
universal, alat uji daya sebar, pisau bedah steril.
E. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan ekstrak daun petai cina
a. Pengumpulan dan pembuatan serbuk daun petai cina. Daun petai cina
diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Daun dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan
kotoran yang menempel pada daun. Daun yang telah dicuci diangin- anginkan kemudian dikeringkan sampai daun benar-benar kering,
ditandai dengan mudah dipatahkan atau hancur bila diremas. Simplisia yang sudah kering diserbuk dengan menggunakan blender. Serbuk
simplisia kemudian diayak. b.
Pembuatan ekstrak daun petai cina. Serbuk daun petai cina sejumlah 25 g dimaserasi dengan 500 mL campuran etanol 96 : air 1:1 terus
menerus selama 3 hari pada suhu ruangan. Ekstrak disaring dengan bantuan pompa vakum dan filtratnya diekstrak lagi menggunakan 500
mL etanol 96 selama 1 hari pada suhu ruangan dan disaring. Kedua ekstrak tersebut dicampur dan diuapkan dengan menggunakan vakum
rotary evaporator hingga volume mencapai 250 mL. Ekstrak disimpan untuk keperluan selanjutnya.
2. Optimasi formula gel
a. Formula. Formula yang digunakan dalam percobaan ini mengacu pada
formula Polyherbal Gel for Wound Healing Patel, Patel, dan Patel,
2011.
Tabel I. Formula polyherbal gel for wound healing Komposisi
Jumlah
Ekstrak daun Centella asiatica bb 2 bb
Ekstrak rimpang Curcuma longa bb 2 bb
Ekstrak kulit batang Terminalia arjuna bb 2 bb
Carbopol 934 bb 2 bb
Propilenglikol 2 ml
Etanol 5 mL
Trietanolamin Secukupnya hingga
basis gel netral Aquadest
Secukupnya Formula diatas selanjutnya dimodifikasi menjadi formula
dengan komposisi variasi gelling agent. Formula yang diperoleh sebagai berikut:
Tabel II. Formula gel hasil modifikasi Komposisi
Jumlah
Ekstrak daun petai cina 6 bb
Natrium alginate 4-6 bb
Na-CMC 4-6 bb
Propilenglikol 2 g
Methylparaben 0,1 bb
Aquadest 81,9 bb
Penelitian ini menggunakan 2 faktor yaitu natrium alginat dan
Na-CMC dengan 2 level yaitu level rendah dan level tinggi. Level rendah dan level tinggi natrium alginat dan Na-CMC pada formula gel
antiinflamasi ekstrak daun petai cina hasil orientasi adalah sebagai berikut:
Tabel III. Level rendah dan level tinggi natrium alginat dan Na- CMC pada formula gel antiinflamasiekstrak daun petai cina
Formula Natrium Alginat bb
Na-CMC bb
1 4
4 a
6 4
b 4
6 ab
6 6
Berdasarkan Tabel III maka dibuat 4 formula gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina sebagai berikut:
Tabel IV. Formula gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina 200 g Formula
1 a
B Ab
Ekstrak daun petai cina 12 g
12 g 12 g
12 g Natrium alginate
8 g 12 g
8 g 12 g
Na-CMC
8 g 8 g
12 g 12 g
Propilenglikol 4 g
4 g 4 g
4 g Methylparaben
0,2 g 0,2 g
0,2 g 0,2 g
Aquadest 163,8 g
163,8 g 163,8 g
163,8 g b.
Pembuatan gel. Pengembangan gelling agent dan proses pencampuran dilakukan didalam ruangan dan LAF yang telah disterilisasi dengan sinar
UV selama 3 jam, pengerjaan dilakukan secara aseptis. Seluruh alat gelas dan logam disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu
121
o
C, sedangkan alat yang terbuat dari plastik disterilisasi dengan sinar UV selama 3 jam dan etanol 70. Natrium alginat disterilisasi dengan
sinar UV selama 3 jam. Na-CMC disterilisasi didalam oven dengan suhu 160
o
C selama 1 jam. Natrium alginat dikembangkan dalam 160 g aquadest steril suhu 40-50
o
C dengan cara ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam aquadest steril sambil diaduk. Na-CMC ditaburkan
secara merata diatas solusi natrium alginat tadi. Pengembangan dilakukan selama 24 jam dan disimpan didalam inkubator. Propylenglikol
disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121
o
C. Methylparaben dilarutkan ke dalam propilenglikol dan diaduk hingga
larut, kemudian ditambahkan sisa aquadest steril. Campuran methylparaben, propilenglikol dan sisa aquadest steril dimasukkan
kedalam gelling agent yang telah dikembangkan sebelumnya, lalu
ditambahkan ekstrak daun petai cina. Semua bahan diaduk kuat menggunakan mixer dengan kecepatan putar level 2 hingga homogen
selama 1 menit.
3. Uji Sterilitas
Uji Sterilitas dilakukan setelah proses pencampuran. Uji sterilitas dilakukan didalam ruangan dan LAF yang sudah disterilisasi dengan sinar
UV selama 3 jam, pengerjaan dilakukan secara aseptis. Seluruh alat gelas dan logam disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121
o
C. Nutrient agar dilarutkan dalam aquadest dengan konsentrasi 28gL, lalu
nutrient agar disterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121
o
C. Nutrient agar steril dimasukkan ke dalam petri dan ditunggu hingga
mengeras. Setiap formula di spread kedalam tiap petri dan diinkubasi selama 24 jam.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji Daya Sebar. Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah
pembuatan, 48 jam dan 4 minggu penyimpanan. Gel ditimbang sejumlah 1 gram kemudian gel diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala.
Di atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian
dicatat diameter sebarnya Garg, et al., 2002. b.
Uji Viskositas. Uji viskositas dilakukan setelah pembuatan, 48 jam dan 4 minggu
penyimpanan. Masing-masing
formula gel
ditentukan
viskositasnya dengan menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04. Ukuran rotor yang digunakan adalah skala 2.
5. Uji aktivitas antiinflamasi
Uji aktivitas antiinflamasi menggunakan 6 ekor tikus. Tikus yang digunakan adalah tikus jantan galur SD yang berumur 2-3 bulan dengan berat
200-300 g. Semua tikus di anastesi terlebih dahulu menggunakan ketamine- xilazine, kemudian diukur tebal kakinya dan dinyatakan sebagai X
. Kaki kiri tiap tikus diinjeksi dengan 0,05 mL karagenin-saline 1. Tikus dibagi
menjadi 2 kelompok, masing-masing terdiri dari 3 ekor tikus. Satu jam setelah penyuntikan, kelompok 1 diberi gel formula 1 secara topikal dan
kelompok 2 tidak diberi perlakuan. Setelah 15 menit kaki tikus diukur dan dinyatakan sebagai X
t
. Pengukuran dilakukan tiap 15 menit selama 3 jam. Presentase inflamasi masing-masing tikus dihitung dengan rumus:
inflamasi = 100
Abdassah, Sumiwi, Hendrayana, 2009.
F. Optimasi dan Analisis Data
Data sifat fisik dan stabilitas fisik gel yang diperoleh dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek dari natrium
alginat, Na-CMC dan interaksinya. Pendekatan desain faktorial digunakan untuk menghitung koefisien b0, b1, b2, b12 sehingga didapatkan persamaan Y = b0 + b1
X1 + b2 X2 + b12 X1X2. Dari persamaan ini kemudian dapat dibuat contour plot sifat fisik gel antiinflamasi ekstrak daun petai cina. Dari masing-masing contour
plot digabungkan menjadi contour plot superimposed untuk mengetahui area
komposisi optimum natrium alginat dan Na-CMC, terbatas pada level yang diteliti. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program R-12.14.1 dengan
uji two way ANOVA pada taraf kepercayaan 95.
28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan dan Pembuatan Serbuk Daun Petai Cina
Daun petai cina diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan diambil pada bulan Agustus 2012. Saat diambil
pohon dalam keadaan berbuah dan masih terlihat beberapa bunga. Tinggi pohon petai cina sekitar 5-6 meter. Sebelum digunakan daun petai cina di determinasi
terlebih dahulu. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan morfologi tanaman petai cina dengan buku kunci determinasi yang ditulis oleh Van Steenis 1992
dan dibuktikan dengan Lembar Pengesahan Determinasi Lampiran 1. Determinasi bertujuan untuk mendapatkan suatu spesiesyang spesifik dan tepat
sasaran, karena tumbuhan memiliki banyak spesies. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang diambil merupakan Leucaena leucocephala
Lam. de Wit. Daun petai cina yang didapat di sortasi basah untuk menghilangkan
pengotor-pengotor yang melekat pada daun, setelah itu dilakukan pengeringan dengan cara diangin-anginkan selama 2 hari. Pengeringan berguna untuk
mengurangi kadar air di dalam daun hingga 10 , karena jika kadar air terlalu tinggi maka dapat mempercepat pembusukan dan dapat menjadi media
pertumbuhan mikroba. Daun yang sudah kering ditandai dengan hancurnya daun ketika diremas.
Kategori