Bahan Hasil Penelitian Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Boerl.)

3.2. Bahan

1. Buah Mahkota Dewa P. macrocarpa Boerl. 2. Etil Asetat Teknis 3. Kloroform p.a Merck 4. Metanol Destilasi 5. HCl 6 6. n-heksana Teknis 7. FeCl 5 8. NaOH 10 9. Mg-HCl 10. H 2 SO 4p 11. Aquades 12. Silika Gel 40 70-230 Mesh ASTM E.Merck.KgaA

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan sampel

Sampel yang diteliti adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari Perumnas Simalingkar Medan, Sumatera Utara. Buah mahkota dewa dihaluskan dengan cara dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan di udara terbuka hingga diperoleh potongan daging buah mahkota dewa kering sebanyak 1170 g.

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daging Buah Mahkota Dewa

Serbuk kering buah mahkota dewa diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa 2. Skrining Fitokimia 3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis Universitas Sumatera Utara

3.3.2.1 Uji Busa

Ekstrak metanol daging buah mahkota dewa sebanyak 5 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml Aquades, lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 5 menit. Melalui perlakuan tersebut dalam sampel terdapat senyawa glikosida.

3.3.2.2 Skrining Fitokimia

Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoida yang terdapat dalam buah mahkota dewa P. macrocarpa Boerl. maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut : Prosedur : - Dimasukkan 10 gram serbuk kering daging buah mahkota dewa P. macrocarpa Boerl. - Ditambahkan 100 ml metanol - Didiamkan selama 1 malam - Disaring - Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi a Tabung I : dengan FeCl 3 1 menghasilkan larutan berwarna hitam b Tabung II : dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan berwarna orange kekuningan c Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna Biru Violet Universitas Sumatera Utara

3.3.2.3 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap Ekstrak Kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F 254 . Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yg digunakan adalah campuran pelarut n-heksana: etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana: etil asetat yang sesuai untuk kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis. Prosedur Analisis Kromatografi Lapis Tipis : Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran n-heksana: etil asetat dengan campuran 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv. Kemudian ekstrak kloroform di totolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar Ultra Violet dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 1. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan perlarut n- heksana: etil asetat 70:30 vv yang memberikan 3 noda dengan harga Rf yaitu 0,55 ; 0,42 dan 0,33.

3.3.3 Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa

Serbuk dari daging buah mahkota dewa ditimbang sebanyak 1170 g, dimasukkan kedalam ekstraktor kemudian ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua sampel terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama ± 72 jam dan sesekali diaduk. Ekstrak disaring dan diperoleh ekstrak berwarna merah kecoklatan. Maserasi dilakukan secara berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol hingga ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa Flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan alat rotari-evaporator pada suhu 60 o C sehingga diperoleh ekstrak pekat Universitas Sumatera Utara metanol, kemudian di ekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk 2 lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Kemudian fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dan kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6. Kemudian disaring dan fitrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali dengan menggunakan alat rotari-evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 14,62 g.

3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom dari buah mahkota dewa yang diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fase gerak yaitu n-heksana 100 dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 vv. Prosedur Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom : Dirangkai alat kolom kromatografi, dimana terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana. Diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian di elusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel dalam kolom padat dan homogen. Dimasukkan 14,62g ekstrak klorofom buah mahkota dewa kedalam kolom kromatografi yang telah diisi dengan bubur silika gel yang telah dielusi. Kemudian ditambahkan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbandingan mulai dari 90:10vv; 80:20vv; 70:30vv, secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa gerak yang keluar dari Kolom Kromatografi sama banyaknya dengan jumlah fasa gerak yang ditambahkan. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml. Kemudian di KLT dan digabung fraksi yang berharga Rf sama. Setelah itu dilakukan uji Flavonoida dan diuapkan pelarutnya.

3.3.5 Pemurnian

Dilakukan pemurnian senyawa yang diperoleh dari hasil Isolasi Kromatografi kolom. Universitas Sumatera Utara Prosedur Senyawa hasil isolasi di rekristalisasi, dengan cara melarutkan kembali dengan Aseton dan kemudian diuapkan di udara terbuka hingga diperoleh kristal murni sebanyak 80mg.

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbadingan 70:30 vv. Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n-heksana: etil asetat kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya telah dilarutkan dengan klorofom pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT yang telah ditotolkan tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes hingga batas atas plat KLT dikeluarkan dari bejana kemudian dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan FeCl 3 5 menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama dilakukan dan difiksasi dengan NaOH 10 yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.

3.3.7 Analisis Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1 Pengukuran Titik Lebur Senyawa hasil Isolasi

Senyawa hasil isolasi memiliki rentangan titik lebur 172 – 174 o C

3.3.7.2 Analisis senyawa hasil isolasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analasis spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang. Universitas Sumatera Utara

3.3.7.3 Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Infra Merah

Analasis spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang.

3.3.7.4 Analsis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analasis dengan spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1 H-NMR dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong Tangerang. Dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Skrining Fitokimia

diekstraksi maserasi dengan metanol disaring ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl 3 1 pereaksi NaOH 10 pereaksi Mg-HCl pereaksi H 2 SO 4p Larutan Biru Violet Larutan Merah Muda Larutan Orange Kekuningan Larutan Hitam 30g buah mahkota dewa kering halus Universitas Sumatera Utara

3.4.1 Bagan Penelitian

Dimaserasi dengan metanol selama ±72 jam Diulangi sebanyak 3 kali Disaring diskrining Fitokimia dipekatkan dengan rotari-evaporator diekstraksi partisi dengan n-heksana diuapkan sampai larutan metanolnya menguap semua dilakukan uji kandungan glukosa dengan menggunakan pereaksi Millon + dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6 sambil dipanaskan selama ± 40 menit didinginkan kemudian disaring diekstraksi partisi dengan Klorofom sebanyak 3 kali diuapkan hingga pekat diskrining fitokimia diuji KLT dengan menggunakan n-heksana : etil asetat 90:10;80:20;70:30;60:40vv dikolom kromatografi dengan fase diam silica gel dan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 ;80:20 ;70:30 ; 60:40vv ditampung tiap fraksi sebanyak 8ml dalam botol vial diuji FeCl 3 1 diuji FeCl 3 1 diuji FeCl 3 1 diuji FeCl 3 1 diuji FeCl 3 1 di KLT digabung fraksi dengan harga Rf sama diuapkan direkristalisasi dengan Aseton dianalisis KLT diukur titik leburnya dianalisis dengan Spektrofotometer UV- Visible, spektrofotometer FT-IR, spektrofotometer 1 H-NMR 1170g daging buah mahkota dewa

P. Macrocarpa Boerl.

residu Ekstrak Klorofom Lapisan metanol-asam residu Lapisan metanol Lapisan n-heksana negatif terhadap pereaksi Flavonoida Ekstrak pekat metanol Ekstrak metanol Fraksi 1 – 67 n-heksana 100 Fraksi 68 – 129 90:10 Fraksi 129 – 170 80:20 Fraksi 284 - 356 60:40 Ekstrak pekat Klorofom Hasil negatif Fraksi 171 – 283 70:30 Hasil negatif Hasil negatif Hasil positif Hasil positif Senyawa murni Hasil Analisis Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil Penelitian

Dari hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak dari buah mahkota dewa dengan menambahkan pereaksi - pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi Flavonoida yaitu: 1. H 2 SO 4p memberikan warna orange kekuningan 2. NaOH 10 memberikan warna biru violet 3. FeCl 3 1 memberikan warna hitam 4. Mg-HCl memberikan warna merah muda Hasil isolasi senyawa flavonoida dari ekstrak buah mahkota dewa P. macrocarpa Boerl., diperoleh dengan menggunakan fase gerak n-heksana: etil asetat 70:30vv yang menghasilkan kristal berwarna kuning kecoklatan sebanyak 80 mg dan memiliki rentangan titik lebur antara 172 – 174 o C. Dari hasil analisis Spektrofotometer Ultra Violet Visible UV-Visible memberikan 2 peak dengan panjang gelombang 209,0 nm dan 331,0 nm Gambar : Hasil Analisis Spektrofotometer Ultra Violet Visible Universitas Sumatera Utara Hasil analisis Spektrofotometer Infra Merah FT-IR dari kristal hasil isolasi memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang cm -1 sebagai berikut Gambar : Spektrum Hasil Analisis Infra Merah Tabel. Gugus Fungsi dan Pita Serapan Hasil analisis FT-IR senyawa hasil isolasi No Rentangan Pita Serapan Gugus Fungsi 1 3211,48 – 3122,75 cm -1 C-H aromatik 2 2985,81 – 2800,64 CH 2 dan CH 3 3 1604,77 C=O Keton 4 1587,42 C=C Aromatik dan Alifatik 5 1446,96 CH 2 6 1382,96 CH 3 Universitas Sumatera Utara 7 1286,24 – 1163,08 C O C C Keton 8 1114,86 C-O 9 1066,64 – 1043,49 C-O-C simetrik 10 925,83 – 893,49 -C=CH Aromatik 11 833,25 C-H Benzen 12 732,96 - 690,52 -CH Aromatik Hasil analisis spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton 1 H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah ppm sebagai berikut Gambar : Spektrum Magnetik Inti Proton 1 H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 1. Pergeseran kimia pada daerah δ= 3.7889 ppm menunjukkan proton- proton dari gugus metoksi O-CH 3 dengan puncak singlet Universitas Sumatera Utara 2. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,0480 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton yang terdapat pada C 6 dan C 8 pada cincin A dan C 3 pada cincin C Marby,T.J 1970 3. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,8596 – 6,8764 ppm dengan puncak doublet menunjukkan C-CH=CH-C pada posisi C 3’ dan C 5’ 4. Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,6299 – 7,6483 ppm dengan puncak doublet menunjukkan C-CH=CH-C pada posisi C 2’ dan C 6’

4.2 Pembahasan