3.2. Bahan
1. Buah Mahkota Dewa P. macrocarpa Boerl.
2. Etil Asetat
Teknis 3.
Kloroform p.a Merck
4. Metanol
Destilasi 5.
HCl 6 6.
n-heksana Teknis
7. FeCl 5
8. NaOH 10
9. Mg-HCl
10. H
2
SO
4p
11. Aquades
12. Silika Gel 40 70-230 Mesh ASTM
E.Merck.KgaA
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan sampel
Sampel yang diteliti adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari Perumnas Simalingkar Medan, Sumatera Utara. Buah mahkota dewa dihaluskan dengan cara
dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan di udara terbuka hingga diperoleh potongan daging buah mahkota dewa kering sebanyak 1170 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daging Buah Mahkota Dewa
Serbuk kering buah mahkota dewa diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1.
Uji Busa 2.
Skrining Fitokimia 3.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.1 Uji Busa
Ekstrak metanol daging buah mahkota dewa sebanyak 5 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml Aquades, lalu dikocok-kocok dengan
kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 5 menit. Melalui perlakuan tersebut dalam sampel terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoida yang terdapat dalam buah mahkota
dewa P. macrocarpa Boerl. maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif
dengan reaksi warna sebagai berikut :
Prosedur : -
Dimasukkan 10 gram serbuk kering daging buah mahkota dewa P.
macrocarpa Boerl.
- Ditambahkan 100 ml metanol
- Didiamkan selama 1 malam
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi
a Tabung I
: dengan FeCl
3
1 menghasilkan larutan berwarna hitam b
Tabung II : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan berwarna orange kekuningan
c Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
d Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna Biru
Violet
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.3 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap Ekstrak Kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yg digunakan adalah
campuran pelarut n-heksana: etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana: etil asetat yang sesuai untuk kromatografi
kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur Analisis Kromatografi Lapis Tipis : Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu
campuran n-heksana: etil asetat dengan campuran 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv. Kemudian ekstrak kloroform di totolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan
kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar Ultra Violet dan
difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
1. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan perlarut n-
heksana: etil asetat 70:30 vv yang memberikan 3 noda dengan harga Rf yaitu 0,55 ; 0,42 dan 0,33.
3.3.3 Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa
Serbuk dari daging buah mahkota dewa ditimbang sebanyak 1170 g, dimasukkan kedalam ekstraktor kemudian ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua
sampel terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama ± 72 jam dan sesekali diaduk. Ekstrak disaring dan diperoleh ekstrak berwarna merah kecoklatan. Maserasi
dilakukan secara berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol hingga ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk
identifikasi senyawa Flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan alat rotari-evaporator pada suhu 60
o
C sehingga diperoleh ekstrak pekat
Universitas Sumatera Utara
metanol, kemudian di ekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk 2 lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Kemudian fraksi metanol
ditampung dan dipekatkan dan kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6. Kemudian disaring dan fitrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform
secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali dengan menggunakan alat rotari-evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 14,62 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom dari buah mahkota dewa yang diperoleh. Fasa diam yang digunakan
adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fase gerak yaitu n-heksana 100 dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat 90:10 ; 80:20 ; 70:30 vv.
Prosedur Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom : Dirangkai alat kolom kromatografi, dimana terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40
70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana. Diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian di elusi dengan
menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel dalam kolom padat dan homogen. Dimasukkan 14,62g ekstrak klorofom buah mahkota dewa kedalam kolom
kromatografi yang telah diisi dengan bubur silika gel yang telah dielusi. Kemudian ditambahkan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbandingan mulai dari
90:10vv; 80:20vv; 70:30vv, secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa gerak yang keluar dari Kolom Kromatografi sama banyaknya dengan jumlah fasa
gerak yang ditambahkan. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml. Kemudian di KLT dan digabung fraksi yang berharga Rf sama. Setelah itu
dilakukan uji Flavonoida dan diuapkan pelarutnya.
3.3.5 Pemurnian
Dilakukan pemurnian senyawa yang diperoleh dari hasil Isolasi Kromatografi kolom.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur Senyawa hasil isolasi di rekristalisasi, dengan cara melarutkan kembali dengan Aseton
dan kemudian diuapkan di udara terbuka hingga diperoleh kristal murni sebanyak 80mg.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbadingan 70:30 vv.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n-heksana: etil asetat kedalam bejana
kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya telah dilarutkan dengan klorofom pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT yang telah
ditotolkan tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes hingga batas atas plat KLT dikeluarkan dari bejana kemudian
dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan FeCl
3
5 menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama
dilakukan dan difiksasi dengan NaOH 10 yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7 Analisis Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Pengukuran Titik Lebur Senyawa hasil Isolasi
Senyawa hasil isolasi memiliki rentangan titik lebur 172 – 174
o
C
3.3.7.2 Analisis senyawa hasil isolasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analasis spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7.3 Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Infra Merah
Analasis spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang.
3.3.7.4 Analsis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analasis dengan spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong Tangerang. Dengan menggunakan Aseton
sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
ditambahkan ditambahkan
ditambahkan ditambahkan
pereaksi FeCl
3
1 pereaksi NaOH 10
pereaksi Mg-HCl pereaksi H
2
SO
4p
Larutan Biru Violet
Larutan Merah Muda
Larutan Orange Kekuningan
Larutan Hitam
30g buah mahkota dewa kering
halus
Universitas Sumatera Utara
3.4.1 Bagan Penelitian
Dimaserasi dengan metanol selama ±72 jam Diulangi sebanyak 3 kali
Disaring
diskrining Fitokimia dipekatkan dengan rotari-evaporator
diekstraksi partisi dengan n-heksana
diuapkan sampai larutan metanolnya menguap semua dilakukan uji kandungan glukosa dengan menggunakan pereaksi Millon +
dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6 sambil dipanaskan selama ± 40 menit didinginkan kemudian disaring
diekstraksi partisi dengan Klorofom sebanyak 3 kali
diuapkan hingga pekat
diskrining fitokimia diuji KLT dengan menggunakan n-heksana : etil asetat 90:10;80:20;70:30;60:40vv
dikolom kromatografi dengan fase diam silica gel dan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 ;80:20 ;70:30 ; 60:40vv
ditampung tiap fraksi sebanyak 8ml dalam botol vial
diuji FeCl
3
1 diuji FeCl
3
1 diuji FeCl
3
1 diuji FeCl
3
1 diuji FeCl
3
1 di KLT
digabung fraksi dengan harga Rf sama diuapkan
direkristalisasi dengan Aseton dianalisis KLT
diukur titik leburnya dianalisis dengan Spektrofotometer UV-
Visible, spektrofotometer FT-IR, spektrofotometer
1
H-NMR 1170g daging buah mahkota dewa
P. Macrocarpa Boerl.
residu
Ekstrak Klorofom Lapisan metanol-asam
residu Lapisan metanol
Lapisan n-heksana negatif terhadap pereaksi Flavonoida
Ekstrak pekat metanol Ekstrak metanol
Fraksi 1 – 67 n-heksana 100
Fraksi 68 – 129 90:10
Fraksi 129 – 170 80:20
Fraksi 284 - 356 60:40
Ekstrak pekat Klorofom
Hasil negatif Fraksi 171 – 283
70:30 Hasil negatif
Hasil negatif Hasil positif
Hasil positif
Senyawa murni
Hasil Analisis
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak dari buah mahkota dewa dengan menambahkan pereaksi - pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia
yang dikandung dengan menggunakan pereaksi Flavonoida yaitu: 1.
H
2
SO
4p
memberikan warna orange kekuningan
2. NaOH 10 memberikan warna biru violet
3. FeCl
3
1 memberikan warna hitam 4.
Mg-HCl memberikan warna merah muda
Hasil isolasi senyawa flavonoida dari ekstrak buah mahkota dewa P. macrocarpa
Boerl., diperoleh dengan menggunakan fase gerak n-heksana: etil asetat 70:30vv
yang menghasilkan kristal berwarna kuning kecoklatan sebanyak 80 mg dan memiliki rentangan titik lebur antara 172 – 174
o
C.
Dari hasil analisis Spektrofotometer Ultra Violet Visible UV-Visible memberikan 2 peak dengan panjang gelombang 209,0 nm dan 331,0 nm
Gambar : Hasil Analisis Spektrofotometer Ultra Violet Visible
Universitas Sumatera Utara
Hasil analisis Spektrofotometer Infra Merah FT-IR dari kristal hasil isolasi memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang cm
-1
sebagai berikut
Gambar : Spektrum Hasil Analisis Infra Merah
Tabel. Gugus Fungsi dan Pita Serapan Hasil analisis FT-IR senyawa hasil isolasi
No Rentangan Pita Serapan Gugus Fungsi
1 3211,48 – 3122,75 cm
-1
C-H aromatik 2
2985,81 – 2800,64 CH
2
dan CH
3
3 1604,77
C=O Keton 4
1587,42 C=C Aromatik dan Alifatik
5 1446,96
CH
2
6 1382,96
CH
3
Universitas Sumatera Utara
7 1286,24 – 1163,08
C O
C C
Keton 8
1114,86 C-O
9 1066,64 – 1043,49
C-O-C simetrik 10
925,83 – 893,49 -C=CH Aromatik
11 833,25
C-H Benzen 12
732,96 - 690,52 -CH Aromatik
Hasil analisis spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR memberikan pergeseran kimia pada daerah ppm sebagai berikut
Gambar : Spektrum Magnetik Inti Proton
1
H-NMR Senyawa Hasil Isolasi
1. Pergeseran kimia pada daerah δ= 3.7889 ppm menunjukkan proton-
proton dari gugus metoksi O-CH
3
dengan puncak singlet
Universitas Sumatera Utara
2. Pergeseran kimia pada daerah
δ= 6,0480 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton yang terdapat pada C
6
dan C
8
pada cincin A dan C
3
pada cincin C Marby,T.J 1970 3.
Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,8596 – 6,8764 ppm dengan puncak doublet menunjukkan C-CH=CH-C pada posisi C
3’
dan C
5’
4. Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,6299 – 7,6483 ppm dengan
puncak doublet menunjukkan C-CH=CH-C pada posisi C
2’
dan C
6’
4.2 Pembahasan