BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Alat – alat
1. Gelas ukur 50 ml
pyrex 2. Gelas Beaker
250 ml pyrex
3. Gelas Erlenmeyer 250 ml
pyrex 4. Corong Saring
5. Corong Pisah 500 ml
pyrex 6. Kolom Kromatografi
pyrex 7. Tabung Reaksi
pyrex 8. Neraca Analitis
Mettler AE 200 9. Alat Pengering
Memmers 10. Rotari Evaporator
Buchi R-114 11. Labu Alas 500 ml
pyrex 12. Alat pengukur titik lebur
Fisher 13. Statif dan klem
14. Lampu UV 254 nm
15. Spatula 16. Pipet Tetes
17. Botol Vial 18. Penangas air
Buchi B-169 19. Plat tetes
20. Batang pengaduk 21. Kapas
22. Bejana Kromatografi lapis tipis 23. Spektrofotometer FT – IR
Shimadzu
Universitas Sumatera Utara
24. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz
25. Spektrofotometer UV – Visibel 26. Kertas Saring
27. Plat KLT MerckKieselgel 60 F
254
3.2 Bahan-Bahan
1. Kulit batang tumbuhan bunga tanjung Mimusops elengi L.
2. Metanol Me-OH Teknis
3. N-heksana Teknis
4. Etil Asetat EtOAc Teknis
5. Aquades 6. Pereaksi Feri Klorida 1
7. Pereaksi Natrium Hidroksida 10 8. Reagent Mg-HCl
9. Reagent H
2
SO
4p
10. Silika gel 60 G type E untuk k.kolom E.merck Art. 7734
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit batang tumbuhan bunga tanjung yang diperoleh dari daerah Padangbulan, Sumatera Utara. Kulit batang tumbuhan bunga tanjung
dikeringkan, lalu dirajang halus sampai diperoleh sebanyak 1000 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Tumbuhan Bunga Tanjung
Serbuk kulit batang tumbuhan bunga Tanjung diidentifikasi dengan menggunakan cara:
1.Uji busa 2.Skrining fitokimia
3.Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1. Uji Busa
Ekstrak metanol kulit batang tumbuhan bunga tanjung sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambah 10 ml akuades dan dipanaskan pada
penangas air . Lalu dikocok–kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam kulit
batang tumbuhan bunga tanjung tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada kulit batang tumbuhan bunga Tanjung, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
Prosedur : Dimasukkan 10 gram serbuk halus kulit batang tumbuhan bunga tanjung
Mimusops elengi L. yang telah dikeringkan ke dalam erlenmeyer. Ditambahkan
metanol 10 ml. Didiamkan. Disaring. Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing pereaksi :
a. Tabung I : dengan HCl 5 menghasilkan larutan berwarna hitam
b. Tabung II : dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutaan orange kekuningan c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Metanol : Etil Asetat dengan perbandingan 90 : 10vv ; 80 : 20vv; 70 :
30vv; 60 : 40vv ; 50:50vv.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis : Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 90 :
10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut
yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf
yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut metanol : Etil asetat 80 : 20vv; 70 : 30vv; 60 : 40vv; 50 :50vv. Dari hasil analisis KLT
menunjukkan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan bunga Tanjung terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak
Metanol : Etil asetat 90:10vv.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak kulit batang tumbuhan bunga tanjung
Kulit batang tumbuhan bunga Tanjung yang telah dirajang ditimbang sebanyak 1000 gram, dimasukkan ke dalam botol perendaman dan dimaserasi dengan pelarut
metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Hasil dari maserasi disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau.
Maserasi dilakukan 2 kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk
identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu 60
C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan
pelarut n-heksan hingga lapisan n-heksana bening dan kemudian ekstrak pekat
Universitas Sumatera Utara
metanol ditampung dan dipekatkan dan dilarutkan dengan etil asetat. Dilakukan skrining fitokimia dan pereaksi yang menghasilkan uji positif dengan pereaksi.
Selanjutnya dipekatkan sampai diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 29 gram.
3.3.4. Analisis Kromatografi Kolom Hasil Isolasi senyawa flavonoida
Analisis kromatografi kolom hasil isolasi senyawa flavonoida dilakukan terhadap ekstrak pekat kulit batang tumbuhan bunga tanjung yang telah diperoleh. Fasa diam
yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut metanol : etil asetat dengan perbandingan 90: 10vv.
Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom: Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel
60 G dengan menggunakan n-heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana
100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 29 gram ekstrak pekat etil asetat ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak
kolom, lalu ditambahkan fasa gerak metanol : etil asetat dengan perbandingan 90:10vv secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom
sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga
Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.
3.3.5. Rekristalisasi Pemurnian
Kristal yang diperoleh dari fraksi yang terbanyak yaitu pada fraksi 20-35 dilakukan pemurnian kristal untuk memastikan kemurniannya.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur : Kristal pada fraksi 20-35 dilarutkan dengan etil asetat, diaduk hingga semua kristal
larut sempurna. Kemudian ditambahkan dengan n-heksana secara perlahan-lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi
larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak metanol : etil asetat 90:10vv.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis: Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan.
Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak
merembes sampai batas tanda plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri Klorida 1 menghasilkan noda berwarna
hitam yang menunjukkan uji positif adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida 10 yang menghasilkan noda
berwarna biru violet. Lampiran C.
3.3.7 Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan kedalam alat pengukur titik lebur, diamati perubahan temperatur sampai diperoleh kristal melebur.
3.3.8. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut. Lampiran D.
3.3.8.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis dengan alat Spektrofotometer Inframerah FT–IR diperoleh dari laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong,
Tangerang. Lampiran F.
3.3.8.23 Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR diperoleh dari laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK
Serpong, Tangerang dengan menggunakan CD
3
OD sebagai pelarut dan TMS sebagai
standart dalam spektrum absorbansi antara 0-17 ppm dibawah TMS. Lampiran G.
3.4. Bagan isolasi senyawa flavonoida dari kulit batang tumbuhan bunga tanjung
Diskrining fitokimia Dimaserasi dengan methanol selama ±72 jam
Disaring
residu Ekstrak metanol
1000 gram kulit batang bunga tanjung
Universitas Sumatera Utara
Dipekatkan dengan rotarievaporator
Diekstraksi partisi dengan n- heksana
Diuapkan hingga semua metanol menguap Dilarutkan dengan etil asetat
Disaring
Diskrining fitokimia
Di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom Dibuburkan sampel dengan silika gel
Dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerakeluen metanol : etil asetat 90:10 vv
Ditampung setiap fraksi sebanyak 8 ml dalam botol vial Di KLT untuk mengetahui harga Rf
Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Di KLT Ditentukan nilai Rf
Diuapkan
Direkristalisasi
Diukur massa
Diuji titik lebur Dianalisis
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak pekat etil asetat
Ekstrak metanol tak diteliti lebih lanjut
Lapisan metanol Lapisan n-heksana
tak diteliti lebih lanjut Ekstrak pekat metanol
FT-IR Ekstrak pekat etil asetat
1
H-NMR UV
Kristal Coklat
Kristal murni coklat Fraksi 1-16
Fraksi 17-19 Fraksi 20-35
Fraksi 35-50
Universitas Sumatera Utara
4.1. Hasil Penelitian